[发明专利]用于测定神经毒素多肽的生物学活性的细胞测试系统

说明书

本发明涉及用于生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括步骤为：a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞；和b)在具有100至270mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含(i)B27补充物和/或(ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。本发明还涉及通过本发明的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。此外，本发明涵盖用于测定神经毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步骤为：a)将通过本发明的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞与神经毒素多肽相接触；b)在允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞3至74小时或72小时；和c)在根据步骤b)培养后，测定所述细胞中神经毒素多肽的活性。最后，本发明提供包含OptiMEM、FBS、B27补充物、和N2补充物的培养基。

本发明涉及用于生成神经毒素敏感的、神经元分化的细胞的方法，所述方法包括步骤为：a)在引发所述肿瘤细胞神经元分化的条件和时间下，在培养基中培养能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞；和b)在具有100至270mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度，并且包含(i)B27补充物和/或(ii)N2补充物的分化培养基中培养a)的经引发神经元分化的肿瘤细胞至少3天，从而获得神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。本发明还涉及通过本发明的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞。此外，本发明涵盖用于测定神经毒素多肽的活性的方法，所述方法包括步骤为：a)将通过本发明的方法可获得的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞与神经毒素多肽相接触；b)在允许神经毒素多肽发挥其生物学活性的条件下培养步骤a)的神经毒素敏感的、神经元分化的细胞3至74小时或72小时；和c)在根据步骤b)培养后，测定所述细胞中神经毒素多肽的活性。最后，本发明提供包含OptiMEM、FBS、B27补充物、和N2补充物的培养基。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)生产强力的神经毒素，即分别是肉毒梭菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异性结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫桥的形成，和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(切割)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链，两链通过二硫键连接。CNT结构上和功能上由3个结构域组成，即，催化轻链、涵盖了易位结构域(N端一半)和受体结合结构域(C端一半)的重链；参见，例如，Krieglstein 1990,Eur JBiochem 188,39；Krieglstein 1991,Eur J Biochem 202,41；Krieglstein 1994,JProtein Chem 13,49。肉毒梭菌神经毒素是作为分子复合物合成的，所述复合物包含150kDa神经毒素蛋白和相关联的无毒蛋白。复合物大小基于梭菌菌株和范围从300kDa，至500kDa以上，和900kDa的不同神经毒素血清型而不同。这些复合物中的无毒蛋白使神经毒素稳定，并保护其免受降解；参见Silberstein 2004,Pain Practice 4,S19–S26。

肉毒梭菌分泌命名为肉毒梭菌神经毒素(BoNT)的A至G的7种抗原性不同的血清型。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)都是Zn2+-内切蛋白酶，其通过切割SNARE蛋白阻断突触的胞外分泌；参见Couesnon,2006,Microbiology,152,759。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中所见的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007,PNAS104,10447。