[发明专利]产生显著均质的聚糖结构的巴斯德毕赤酵母菌株

说明书

交叉参考相关申请

本申请要求2012年10月23日提交的美国临时申请号61/717,423的优先权利益，该临时申请的整个内容通过引用并入本文。

发明背景

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是用于产生广泛多样的重组蛋白的非常成功的系统。若干个因素促成了其迅速的认可，包括：(1)来源于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的醇氧化酶I(AOX1)基因的启动子，其独特地适合用于异种基因的受控表达；(2)巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作所需的技术与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的技术的相似性；和(3)巴斯德毕赤酵母对呼吸性生长的强烈偏好，这是相对于发酵性酵母促进其在高细胞密度下的培养的生理性状。

作为酵母，巴斯德毕赤酵母是容易操作和培养的单细胞微生物。然而，其还是真核生物并能够发生由较高等真核细胞进行的翻译后修饰例如蛋白水解加工、折叠、二硫键形成和糖基化。因此，在细菌系统中会终止为无活性包涵体的许多蛋白质在巴斯德毕赤酵母中被产生为生物活性分子。巴斯德毕赤酵母系统还通常被认为比来源于较高等真核生物例如昆虫和哺乳动物组织培养细胞系统的表达系统更快速、更简化和较不昂贵地使用，并且通常产生更高的表达水平。

巴斯德毕赤酵母具有进行许多通常与较高等真核生物相关的翻译后修饰的潜能。这些包括信号序列(前-和前原-型两者)加工、折叠、二硫键形成以及O-和N-连接的糖基化。巴斯德毕赤酵母和其它真菌对分泌的异种(较高等)真核生物蛋白质的糖基化可以是成问题的。在哺乳动物中，O-连接的寡糖由多种糖包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸组成。相反，较低等的真核生物包括巴斯德毕赤酵母，可添加仅由甘露糖(Man)残基组成的O-寡糖。

巴斯德毕赤酵母中的N-糖基化也与较高等真核生物中的不同。在所有的真核生物中，N-糖基化起始于ER中，将脂质连接的寡糖单元即Glc3Man9GlcNAc2(Glc＝葡萄糖；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺)转移至识别序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺。该寡糖核心单元随后被修剪为Man8GlcNAc2。正是在这一点上较低等和较高等真核生物糖基化模式开始不同。哺乳动物高尔基体进行一系列修剪和添加反应来产生包含Man5-6GlcNAc2(高甘露糖类型)、几种不同糖类的混合物(复合型)或两者的组合(杂种型)的寡糖。在由巴斯德毕赤酵母分泌的异种蛋白上已观察到两种不同的N-糖基化模式。一些蛋白被分泌为具有在大小和结构上与核心单元(Man8-11GlcNAc2)相似的碳水化合物结构。其它从巴斯德毕赤酵母分泌的异种蛋白接受远更多的碳水化合物并显得是过度糖基化的。

由酵母添加至蛋白质的N-连接的高甘露糖寡糖代表了制药工业对异种分泌蛋白的使用中的问题。例如，当被静脉内引入哺乳动物中时，它们可以是非常抗原性的并且还可引起蛋白质通过肝脏从血液的快速清除。

在尝试修饰巴斯德毕赤酵母的N-糖基化途径的过程中，产生了一种菌株(此后被称作为“M5-Blast”)，如Jacobs等人,2009,Nature Protocols 4:58-70中所描述的。M5-Blast是改良的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，其中内源甘露糖基转移酶基因OCH1被引入包含α-1,2-甘露糖苷酶基因的盒破坏。然而，M5-Blast菌株经历基因组重排，其在冷冻和解冻循环、于不同温度和条件下的生长之后并从利用其它质粒的随后转化中引入外源基因之后，重新产生内源OCH1基因并且同时去除α-1,2-甘露糖苷酶基因。

公开内容概述

本文公开了用于表达具有基本上均质的N-聚糖的外源蛋白的新型巴斯德毕赤酵母菌株。更具体地，所述菌株经遗传工程化以包含被转录为编码突变OCH1基因产物(即α-1,6-甘露糖基转移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突变OCH1等位基因。突变型OCH1蛋白包含与野生型OCH1蛋白的催化结构域基本上相同的催化结构域，但具有改变OCH1蛋白至高尔基体或在高尔基体中的定位的N-末端序列。所述菌株不包含任何其它的产生编码功能性OCH1蛋白的mRNA的OCH1等位基因。这样的菌株是健全的、稳定的和可转化的，并且突变OCH1等位基因和相关的表型(即产生基本上均质的N-聚糖的能力)在冷冻和解冻循环后且在随后的转化后得到世代维持。

本公开内容还表征了构建所述菌株的方法以及通过该菌株表达蛋白的方法。