[发明专利]用于产生单糖的方法

说明书

本发明涉及用于使用微生物来产生单糖的方法。该微生物具有糖基转移酶和糖苷酶，其一起工作以合成所期望的游离形式的单糖，其中通过使用内源性提供的核苷酸活化的单糖、糖基化适宜的受体底物并通过水解反应释放所期望的单糖。再循环并仅需要催化量的用于反应所需要的受体底物。以游离形式来产生单糖并且获取自所培养的微生物的上清。

本发明涉及用于产生单糖、尤其是用于产生L-岩藻糖或其他稀有单糖例如N-乙酰基神经氨酸的方法，借此在该生产方法中使用微生物。

通过在能量储存、结构功能、信号传导、信息存储等中承担关键功能，糖类在所有形式的生命中是必要的。对于此任务，自然界合成了几种主要单糖如葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、核糖、唾液酸等，以及用于更加专门应用的若干次要单糖，如例如D-阿洛糖。

虽然一些单糖可以大量地并以合理的成本获自自然界(例如葡萄糖和果糖)，但大多数单糖是相当稀有的并且仅可以少量存在于自然界中，如例如L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)。

对于单糖的商业化生产，几乎仅有获自自然界的寡糖被用作来源。这些寡糖是酸水解的并且从释放的单糖来纯化单种糖。由于单糖的高化学相似性(彼此之间的差异大部分仅在于个别羟基的取向)，所以以纯形式分离单种单糖是相当费力和昂贵的。

L-岩藻糖代表这样的稀有糖，其目前是经由复杂寡糖的水解而获自藻类或细菌来源。为了从复杂的水解产物来纯化单种单糖，经常必须使用有毒化学物质，如例如乙酸铅和过量的有机溶剂。因此，从寡糖的复杂的水解产物来分离单种单糖具有挑战性(由于释放的单种单糖的高化学相似性)并且是环境有害的(由于过度使用有毒化学物质，如碳酸铅)。此外，在自然界中在某些糖中富含的寡糖的可用性可以是相当受限制的并且也是高度可变的(由于季节变化)。L-岩藻糖代表这样的稀有单糖，其传统上是通过含岩藻糖的多糖的酸水解来获得的。岩藻糖主要源自多糖岩藻多糖，一种岩藻聚糖单硫酸酯，存在于所有常见的棕色海草中，其包括鹿角菜科(Fucaceae)和海带科(Laminariaceae)。今天，L-岩藻糖的大量获得主要是通过采集属于鹿角菜科的棕色海草，其可在全球范围内找到，但大量存在于大西洋的欧洲海岸。从海岸大规模收获棕色海草起环境关注并且受限于某些环保法规。

例如，JP 2000351790公开了用于提取岩藻多糖和用于从提取的岩藻多糖来获得和分离含岩藻糖的寡糖的方法。

除从棕色海草水解岩藻多糖之外，最近，专利出版物表明，还可以经由包含天然存在的L-岩藻糖的细菌多糖的水解来获得L-岩藻糖：WO 2012/034996 A1公开了属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的菌株，该菌株能够产生包含L-岩藻糖的胞外多糖。为了生产L-岩藻糖，回收通过上述菌株产生的多糖并对其进行水解，例如通过用硫酸或盐酸加以处理。

除从多或寡糖水解产物提取L-岩藻糖之外，还已经开发了开始于其他单糖如L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-葡萄糖的用于L-岩藻糖的若干合成途径。通常，这些化学合成的产率往往相当差并且涉及若干步骤。除涉及若干合成步骤之外，大量的保护基团化学反应还必须用于L-岩藻糖的化学合成。通常，相比于从自然界提取，还没有证明单糖的大规模化学合成是经济上可行的。

因此，目前，以纯形式制备任何单糖在将其他单糖与目标单糖纯化分开方面需要显著努力，往往涉及大量的有机溶剂和其他有毒化学物质。因此，单一的所期望的单糖如例如L-岩藻糖的排他积累会是非常有用的。大多数微生物在它们能够利用的单糖的种类方面是受限的。此外，在同时可以获得几种单糖作为碳源时，它们对某些单糖经常施加强的偏好。

鉴于上述，本发明的一个目的是提供用于生产游离形式的单一所期望的单糖的新方法，借此，可以快速和有效地，即大规模和成本有效地获得单糖而没有负面的环境影响。

通过用于产生单糖的方法，即大规模地、以游离形式、并利用微生物来实现上述和其他目的，该方法包括以下步骤：