[发明专利]多孔基体支持物的表面修饰

说明书

本发明涉及具有改善结合能力的新型分离材料、其制造和应用，尤其是用于结合蛋白A的应用。

发明背景

蛋白A和单克隆抗体的纯化

由于单克隆抗体(mAb)用于药学应用，所以它们需要纯度非常高[A. Jungbauer, G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。

蛋白A最初是最早在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的56 kDa表面蛋白。其由spa基因编码，且其调节由DNA拓扑学、细胞渗透性和称为ArlS-ArlR的双组分系统所控制。因为其结合免疫球蛋白的能力，在生化研究中已发现其用途。其最初由五个折叠成三螺旋束的同源的结合Ig的结构域构成。各结构域能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白，最主要是IgG。其结合大部分免疫球蛋白的Fc区内的重链以及在人VH3家族的情况下在Fab区内的重链。通过这些在血清中的相互作用，其中IgG分子以错误定向(相对于正常抗体功能)结合，该细菌破坏调理作用和吞噬作用。

此处，术语蛋白A和Prot A可互换使用且包括从其天然来源回收的蛋白A、合成产生的蛋白A(例如通过肽合成或通过重组技术)、和其保留结合具有CH₂/CH₃区(诸如Fc区)的蛋白的能力的变体。蛋白A可商购自Repligen, GE或Fermatech。蛋白A通常固定在层析基质上。根据本发明的方法和系统中所使用的蛋白A的功能性衍生物、片段或变体的特征可以是对于小鼠IgG2a或人IgGI的Fc区的结合常数至少为K=I0⁸ M，优选为K=I0⁹ M。顺应此类结合常数的值的相互作用在本上下文中称为高亲和力结合。在一些实施方案中，蛋白A的此类功能性衍生物或变体包含至少一部分野生型蛋白A的功能性IgG结合结构域，其选自天然结构域E、D、A、B、C或其已经保留IgG结合功能的工程改造的突变体。

此外，工程改造使得单点连接至固体支持物的蛋白A衍生物或变体也可用于所要求保护方法中的亲和层析步骤。

单点连接通常意指蛋白部分经由单一共价键连接至蛋白A亲和层析的层析支持材料。该单点连接也可通过使用置于接近该蛋白折叠的N或C末端或在蛋白折叠的外部环境别处的暴露的氨基酸位置(即，在环中)的合适反应性残基而发生。合适的反应性基团是例如巯基或氨基官能团。

在一些实施方案中，变体的蛋白A衍生物经由多点连接而连接至合适的层析基质。

通常，生物技术过程仅提供非常低浓度的高度不纯mAb，使得这些杂质的去除需要一组复杂分离和纯化步骤，也称为下游过程。该下游过程的效率显著影响mAb的制造成本，这导致对每一相继步骤的程序改善的持续目标[R. Freitag 和 C. Horváth; Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17-59]。在所有涉及的过程步骤中，蛋白A层析(也称为亲和层析)始终是最重要且昂贵的步骤。这意指蛋白A亲和层析是单克隆抗体mAb的下游处理中最重要的纯化步骤之一。

详细地，粗制多组分溶液通过填充包含在固体多孔支持物上的固定蛋白A的固定相的柱。所期望的mAb通过mAb与蛋白A之间的特异性相互作用而被捕获，同时杂质与离开的溶剂一起离开该柱。被捕获的mAb通过使用适当洗脱剂来回收[P. Cuatrecasas, M. Wilchek, C. B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, 636 (1968)]。

实践中，该结合和洗脱操作由一系列的几个步骤组成。在第一步骤中，以缓冲液洗涤将上样含有目标分子的进料流的柱。下一步骤中，将含有目标mAb和杂质的进料流通过该含有蛋白A固定相的柱。在该步骤中，通过目标mAb分子对于蛋白A的特异性亲和力来捕获该目标mAb分子，而杂质大部分通过。随后，以洗涤缓冲液冲洗该固定蛋白A相，以去除残留杂质。然后通过使洗脱缓冲液通过该柱来回收(洗脱)所捕获的mAb分子。mAb的洗脱由该洗脱缓冲液所产生的诱导目标mAb分子与蛋白A之间的亲和力偏移的化学环境导致。该柱最终得到清洁和再生以重复mAb的结合和洗脱更多循环。