[发明专利]细菌设计

权利要求书

1.一种在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过采用活化转座子(Tn_A)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述Tn_A包含能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子；

(b)在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由突变体集合生长细菌从而产生两种以上测试培养物；和

(c)比较测试培养物之间Tn_A插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基因。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至少一种所述有利基因过表达的设计的突变体细菌的步骤，使得所述突变体细菌在所述选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长。

3.根据权利要求2所述的方法，其中多种所述不利基因被去除或破坏。

4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中多种所述有利基因过表达。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，进一步包括培养所述设计的突变体细菌并随后对所述设计的突变体细菌实施权利要求1的步骤(a)-(c)以识别出在所述选择的生长条件下不利于生长和/或存活的另外的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的另外的第二类基因。

6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述另外的不利基因被去除或破坏和/或至少一种所述另外的有利基因过表达的第二轮设计的突变体细菌的步骤，从而相对于权利要求2所述的设计的突变体细菌在所述选择的生长条件下所述突变体细菌表现出改善的存活和/或生长。

7.根据权利要求6所述的方法，包括一个或多个另外轮的诱变并重复实施权利要求1所述的步骤(a)-(c)以提供相对于前一轮的设计的突变体细菌在所述环境挑战存在下表现出改善的存活和/或生长的第三或更多轮突变体细菌。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不利基因的去除和/或破坏包括基因组最小化。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括将质粒DNA整合至细菌染色体中并随后解离共合体。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括在线性DNA末端通过短同源臂介导的同源重组。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将至少一种异源基因引入到所述细菌中的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因有利于在所述选择的生长条件下生长和/或存活。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，包括将异源基因簇引入到所述细菌中的步骤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物合成路径。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物合成路径产生次级代谢产物。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物降解路径。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因编码治疗性蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗性蛋白选自：

(a)酶；

(b)抗体；

(c)抗原；

(d)毒素；

(e)配体结合蛋白；

(f)抗生素；

(g)肽；和

(h)细胞因子。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择的生长条件包括存在以下各项：

(a)环境污染物；

(b)工业废弃产品；

(c)医疗废弃产品；

(d)药物或候选药物；

(e)选择的碳源，例如烃；

(f)一种或多种其它生物，例如微生物和病毒。