[发明专利]细菌设计

说明书

技术领域

本发明涉及设计(工程化，engineering)适用于生物技术应用，包括蛋白、次级代谢产物(secondary metabolite)和生物燃料的生产，生物催化，生物治理(生物修复，bioremediation)，生物转化，生物降解，生物学控制，药物开发，药物筛选，疫苗，益生菌，生物传感器和药物递送载体(drug delivery vehicle)的细菌细胞的方法。

背景技术

细菌在生物技术的许多方面都找到了应用，包括用作生产异源蛋白和肽(包括酶和治疗性抗体)的宿主，作为次级代谢产物或其衍生物的源，作为生物学控制，生物降解，生物燃料生产，生物催化和生物治理的试剂和作为益生菌，疫苗组分和药物递送体系。

天然细菌菌株对于生物技术用途并未优化。合成生物学这一新兴领域的目标之一是设计(工程化，engineering)更易于处理和/或更有效的作为生物技术工具的新型生物。

一种方法可以称为“粉碎(ground-up)”方法(例如，见WO2008/024129)。这涉及到只包含那些生长必不可少的基因的最小化的人工细菌DNA基因组的合成。这然后用于产生按照需要可以向其增加所需的生物合成路径，信号传导途径或分解代谢功能的裸“框架”(bare“chassis”)。这种方法目前是不切实际的，因为基因产物和调控元件会协同和串扰于整个细胞的环境中，其方式当前还不完全理解并因此不能作为正式模块进行处理。

另一种方法称为“剥离(strip down)”方法。目前这在链霉菌(Streptomyces spp.)有用的次级代谢产物的生产中找到了应用。此处，不是生长必需的基因和其它遗传物质将被去除(“剥除(stripped out)”)，而逐个重新引入用于选定的生物合成路径的那些。例如，Komatsu等(Komatsu et al.(2010)PNAS 107(6):2646-2651)描述了用于编码次级代谢产物生物合成的基因的异源表达的设计的(工程化，engineered)细菌的构建，这涉及从工业微生物阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)基因组中系统地删除非必需基因。

所述“剥离”方法需要识别对于所选条件下存活和/或生长非必要的(和从而代谢高成本性的以及因此不利的)基因的方法。

此外，这种方法将受益于互补功能基因组分析还识别出有利于所提出的生物技术应用的基因。在后一种情况下，“剥离(strip down)/增产(rev-up)”方法随后能用于最小化由非必要(不利的)基因所引起的代谢负担，同时放大直接或间接有助于所述生物技术应用的基因(即，有利基因)的有益作用。

转座子定向插入位点测序(transposon directed insertion-site sequencing)(TraDIS-见Langridge et al.(2009)Genome Research 19:2308-2316)最近已经被描述并用于识别：(a)必需基因；(b)有利生长的(但非必需的)基因；(c)在特定条件下不利生长的基因；和(d)参与对某些条件提供耐受性的基因(“壁龛特异性的(niche-specific)”必需基因)。类似的技术已描述于例如，Gawronski et al.(2009)PNAS 106：16422-16427；Goodman et al.(2009)Cell Host Microbe 6:279-289；van Opijnen et al.(2009)Nat.Methods 6:767-772和Gallagher et al.(2011)mBio 2(1):e00315-10，并且这种技术现在统称为“Tn-seq”方法。

现在本发明人已经发现，TraDIS能够适于为细菌生物设计(生物工程，bioengineering)目的明确地识别出不利的和有利的基因的问题提供非常巧妙的解决方案。这通过使用活化转座子(Tn_A)而实现。这些转座子包括启动子从而使转座子在合适的插入位点插入到细菌DNA中增加了插入位点处或接近基因的转录。因此采用Tn_A的诱变产生插入失活的突变体(其中所述Tn_A破坏了基因表达，通常在插入到编码区中之后)以及插入活化的突变体(通常在转座子已插入到基因的上游，从而使所述启动子驱动所述基因高水平的转录(以及因此产生更高水平的表达)。

发明内容

根据本发明，提供了生产在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的方法，所述方法包括以下步骤：