[发明专利]测定肉毒杆菌神经毒素的生物活性的手段和方法

权利要求书

1.一种编码融合多肽的多核苷酸，所述融合多肽包含由包含神经毒素切割位点的接头隔开的(i)转录因子结构域和(ii)胞质滞留结构域。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述胞质滞留结构域是跨膜蛋白或跨膜蛋白的跨膜结构域。

3.权利要求2的多核苷酸，其中所述跨膜蛋白选自下组：质膜神经递质转运蛋白、离子通道、G-蛋白偶联受体和膜受体。

4.权利要求1的多核苷酸，其中所述胞质滞留结构域是膜锚定蛋白或膜锚定蛋白的膜锚定结构域。

5.权利要求4的多核苷酸，其中所述膜锚定蛋白选自下组：SNAP-25、突触融合蛋白、小突触小泡蛋白、突触结合蛋白、囊泡关联膜蛋白(VAMP)、突触囊泡糖蛋白(SV2)、高亲和力胆碱转运蛋白、Neurexin、电压门控钙通道、乙酰胆碱酯酶和NOTCH。

6.权利要求1的多核苷酸，其中所述胞质滞留结构域选自下组：球状蛋白质和细胞骨架锚定蛋白。

7.权利要求1至6中任一项的多核苷酸，其中所述转录因子结构域包括含DNA结合结构域和反式激活子或沉默子结构域的转录因子。

8.权利要求7的多核苷酸，其中所述转录因子选自：四环素依赖的反式激活子(tet-阻遏物-VP 16)，类固醇激素受体、NOTCH、NFκB、p53、NFAT、MLL、E2A、HSF1、NF-IL6、STAT、R-SMAD、GAL4和SP1。

9.一种载体，包含权利要求1至8中的任一项的多核苷酸。

10.一种融合多肽，由权利要求1至8中的任一项的多核苷酸编码。

11.一种宿主细胞，包含权利要求1至8中的任一项的多核苷酸，权利要求9的载体或权利要求10的融合多肽。

12.权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：原代神经元细胞、神经母细胞瘤细胞系、细胞系N1E-115、细胞系Neuro2a、细胞系SH-SY5Y、细胞系PC12、细胞系SiMa、细胞系MHH-NB-11、细胞系SK-N-BE(2)和诱导的多能干细胞。

13.权利要求11或12的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含报告子基因，其表达受在融合多肽剪切后的转录因子结构域的调控。

14.一种测定样品中的神经毒素活性的方法，包括以下步骤：

(a)使包含权利要求10的融合多肽和报告子基因的宿主细胞与疑似含有神经毒素活性的样品接触，所述报告子基因的表达受在所述融合多肽剪切后的转录因子结构域的调控；和

(b)测量所述报告子基因的活性，由此测定样品中的神经毒素活性。

15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞是权利要求11至13中任一项的宿主细胞。

16.权利要求1至8中任一项的多核苷酸，权利要求9的载体，权利要求10的融合多肽或权利要求11或13的宿主细胞在确定样品中的神经毒素活性中的应用。

17.一种用于测定神经毒素活性的试剂盒，包括权利要求1至8中任一项的多核苷酸，权利要求9的载体，权利要求10的融合多肽或权利要求11或13的宿主细胞以及，优选用于检测报告子基因活性的检测剂。