[发明专利]测定肉毒杆菌神经毒素的生物活性的手段和方法

说明书

本发明涉及用于测定神经毒素活性的手段以及方法。具体地，本发明涉及编码融合多肽的多核苷酸以及由本发明的多核苷酸编码的融合多肽，所述融合多肽包括由包括神经毒素切割位点的接头隔开的(i)转录因子结构域和(ii)胞质滞留结构域。还包括包含本发明多核苷酸的载体和包含本发明的多核苷酸、载体或融合多肽的宿主细胞。此外，还包括用于测定样品中的神经毒素活性的方法。此外，本发明涉及本发明的多核苷酸、载体、融合多肽或宿主细胞在测定样品中的神经毒素活性中的应用。最后，本发明涉及一种用于测定神经毒素活性的包含本发明的多核苷酸、载体、融合多肽或宿主细胞的试剂盒。

肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生高效的神经毒素，即分别为肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素特异性地结合神经细胞并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白质。翻译后加工涉及二硫桥的形成，以及细菌蛋白酶的有限蛋白水解(切割)。活性的二链神经毒素由通过二硫键连接的N-端约50kDa的轻链和约100kDa的重链两条链组成。神经毒素在结构上由三个结构域组成，即催化轻链、包含易位结构域(N端的一半)的重链和受体结合结构域(C端的一半)，参见Krieglstein 1990,Eur.J.Biochem.188,39；Krieglstein1991,Eur.J.Biochem.202,41；Krieglstein 1994,J.Protein Chem.13,49。

肉毒杆菌分泌7种抗原性不同的血清型，被称为BoNT的A至G型。所有血清型和由破伤风梭菌分泌的相关TeNT是通过剪切SNARE蛋白(尤其是SNAP-25)而封闭突触的胞吐作用的锌(Zn²⁺)-依赖的内切蛋白酶。尤其是，BoNT在肉毒中毒和破伤风中引起弛缓性肌肉麻痹，参见Fischer 2007,PNAS 104,10447。

尽管其毒性作用，但BoNT已被用作大量疾病的治疗剂。在1989年BoNT血清型A(BoNT/A)被美国批准用于人的斜视、眼睑痉挛和其他疾病的治疗。它作为蛋白制剂是可商购的，例如，以商品名BOTOX(Allergan Inc)，以商品名Dysport(Ipsen Ltd)。对于治疗性应用，将复合物直接注射到待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白复合物释放，并且产生所希望的药理学效应。不含复合物蛋白的改进的BoNT/A制剂是以商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得的。

BoNT在原则上减弱随意肌强度，因此，是斜视、包括颈肌张力障碍的灶性张力障碍，以及良性自发性睑痉挛的有效治疗剂。它们已进一步显示出减轻单侧面部痉挛和局限性痉挛，而且，对多种其他的适应症如胃肠病症、多汗以及美容除皱是有效的，参见Jost 2007,Drugs 67,669。

生物活性的测定作为安全措施，用于质量控制和定量目的是很重要的。WO 95/33850描述了基于非竞争性测定法用于定量神经毒素的生物活性的方法。在这些方法中，包括用于神经毒素的切割位点的底物结合到固相上。加入神经毒素导致底物的剪切。剪切产物然后通过，例如，缀合到酶的特异性抗体而进行检测。这样的非竞争性测定法的一个缺点是，所获得的测试结果可能是不均匀的，因此是不可靠的。