[发明专利]用于增强PCR特异性的新颖组合物、方法和试剂盒

说明书

本发明提供用于检测特异性核酸序列的新颖引物和方法。本文中提供的引物和方法适用于各种分子生物学应用并且特别适用于等位基因特异性PCR。

相关申请

本申请根据35U.S.C.119(e)要求2012年12月20日提交的美国临时专利申请第61/740,242号的权益，和根据35U.S.C.119(e)要求2012年11月2日提交的美国临时专利申请第61/721,968号的权益，所述申请中的每一个在此以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及分子生物学领域。具体来说，本发明涉及适用于检测并且区分核酸的新颖引物。

背景技术

能够检测样品中的特定核酸分子的存在并对其进行定量的分析在法医学、医学、流行病学和公共卫生中相当重要。所述分析可以用于例如鉴别传染病的病因，预测个体将患上遗传疾病的可能性，测定饮用水或牛奶的纯度，或鉴别组织样品。提高所述分析的效用和适用性的愿望通常因分析灵敏度而受阻。因此，非常希望研发出更灵敏的检测分析。

核酸检测分析可以基于核酸分子的任何特征，例如其大小、序列，并且如果是DNA，那么还可以基于通过限制性核酸内切酶消化的易感性。所述分析的灵敏度可以通过改变向观察者报告或发信号通知检测结果的方式来提高。因此，举例来说，可以通过使用可检测地标记的试剂来提高分析灵敏度。出于此目的，已经使用了多种多样的所述标记。可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。

虽然使用高度可检测标记的试剂可以改善核酸检测分析的灵敏度，但是所述分析的灵敏度仍然受到一些因素的限制，所述因素包括(但不限于)非特异性反应，所述非特异性反应增加了背景信号和区分相差一个或几个核苷酸的序列的限制。针对这些问题，已经研发出了使用DNA扩增的各种检测和定量方法。

通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA使用引物对，所述引物的序列决定了扩增的特异性。然而，在引发区以外的扩增子序列对扩增特异性的贡献极少或无贡献。在典型的PCR反应中，使用正向和反向引物优先靶向并且扩增相关DNA序列。在分析中，还提供了从扩增子序列内选取的探针来选择性地检测并且监控扩增产物。目标序列中在引物和探针区以外的其余部分不采用。仍然需要提高扩增反应的特异性，尤其是对于相差一个或几个核苷酸的样品的扩增来说。所述分析的实例包括(但不限于)基因分型、稀有等位基因检测和突变体序列的预扩增。

发明内容

本文中提供了用于检测目标核酸分子的组合物、方法和试剂盒。

一方面，提供寡核苷酸(本文中称为“STAR(目标特异性扩增限制)引物”或“*引物”)，其包含(i)序列标签，本文中称为“STAR标签序列”和(ii)某一序列，所述序列与目标核酸杂交并且引物从其延伸，拷贝目标核酸，产生延伸产物。STAR标签序列与STAR引物的延伸产物3'的部分互补，延伸产物的互补部分在本文中被称作STAR标签目标区。当STAR引物杂交到目标核酸并且延伸时，延伸产物包含在5'端的STAR标签序列和在延伸产物的3'区中的STAR标签序列的互补序列(即，STAR标签目标区)。因此，STAR引物延伸产物可以回折自退火，由此形成茎-环结构。

在某些实施例中，STAR标签序列在STAR引物的5'端或在STAR引物的5'端附近。在某些实施例中，STAR标签序列与用于在扩增反应中扩增延伸产物的另一个引物序列的结合位点的全部或一部分互补。

一方面，提供包含STAR引物的组合物。在某些实施例中，提供包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的组合物，其中第一引物包含与第二引物的目标核酸杂交序列的全部或一部分相同的STAR标签序列。在某些实施例中，第一和第二引物是正向和反向扩增引物对。