[发明专利]基因工程酵母

说明书

本发明涉及基因工程酵母和它们在生产3-羟基丙酸(3HP)的方法中的用途。

3HP是一种平台化合物，其可转化成丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸和其他有价值的产品。源自丙烯酸的产品包括用于婴儿尿布和失禁产品、各种塑料、涂料、粘合剂、弹性体和油漆中的超强吸收性聚合物。目前，丙烯酸来自丙烯，丙烯是乙烯和汽油生产中的一种副产物。从葡萄糖或其他可再生碳源建立3HP生产将针对从化石资源的丙烯酸生产提供生物可持续的替代方案。已经描述了几种从葡萄糖生产3HP的方法。但是，具体的教导主要使用细菌大肠杆菌作为宿主。本发明使用酵母作为生产3HP的宿主。这使得能够在低pH下进行该过程并且因此使该过程总体更经济。

US2010/0136638大体描述了在包括酵母的微生物中通过生物催化从β-丙氨酸生产3-HP。据称β-丙氨酸可在细胞中利用具有丙氨酸2,3-氨基变位酶活性的酶由α-丙氨酸合成，并且给出了相关酶的序列。

也公开了使用β-丙氨酸/丙酮酸转氨酶(BAPAT)序列由β-丙氨酸生产3-HP的方法。公开了具有BAPAT活性的转化细胞，其使得细胞能够将β-丙氨酸通过丙二酸半醛中间体转化成3-HP。

尽管提到了在酵母中进行这种工作的可能性，但并没有实践证据。我们发现，在大肠杆菌中有效的该通路中的酶在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中是无效的。尤其是，根据US2010/0136638，具有BAPAT活性的酶可获得自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。但是，我们已经发现编码这些酶的基因在酿酒酵母中是无效的。

丙二酸半醛(或丙二酸半醛或3-氧代丙酸)是产生3HP的一个通路中的关键中间体，但是可能有许多生产3HP的不同路径。

US2012135481描述了酵母中的包括编码gabT、3-HPDH和HIBADH基因和其他基因的3HP产生通路。但是，需要其他的和更好的生产3HP的酵母。

我们现已发现，当异源表达来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)AH1272的未表征的转氨酶yhxA时，在酵母酿酒酵母中获得了由β-丙氨酸生产的3HP。所述yhxA编码的转氨酶的氨基酸序列列于SEQ ID NO1中，并且DNA序列列于SEQ ID NO2中。SEQ ID NO2针对酿酒酵母进行了密码子优化。

我们认为，来自蜡状芽孢杆菌AH1272的所述转氨酶YhxA催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应，产生L-丙氨酸和丙二酸半醛，在这种情况下，酶应该是β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶E.C.2.6.1.18(BAPAT)，而不是gabT(E.C.2.6.1.19)。

US2012/0135481大体公开了一种基因修饰酵母细胞，其包含包括BAAT基因(β丙氨酸氨基转移酶-EC 2.6.1.19)的活性3-HP发酵通路，BAAT基因催化[β]-丙氨酸转化成丙二酸半醛。所以，这里的BAAT与天然存在的或基因修饰的gabT同义。但是，并未表明通过该方法成功生产了3-HP。

WO2005/118719公开了在酵母细胞中使用来自任何生物体的β-丙氨酸/丙酮酸转氨酶(BAPAT)序列由β-丙氨酸生产3-HP的方法，但是并未表明该方法的有效性。这里，经鉴定的BAPAT的来源包括假单胞菌、拟南芥、大鼠和非洲爪蟾。如上所述，我们已经确认，来自假单胞菌的BAPAT基因在酿酒酵母中是无效的。

yhxA的Uniprot条目提供了序列，但并未将该酶鉴定为BAPAT。

因此，本发明现在提供了基因修饰酵母细胞，其包含生产3-HP的活性发酵通路，其中，所述细胞包含并表达编码用于产生酶的外源性基因，所述酶与SEQ ID NO：1具有至少80％的同一性并催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛。