[发明专利]具有小型启动子盒的逆转录病毒载体

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年10月25日提交的美国临时专利申请第61/718,610号的优先权，其公开的内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及治疗细胞增殖的逆转录病毒复制型载体(RRV)。本公开还涉及使用这些逆转录病毒复制型载体递送和表达异源核酸。

发明背景

递送基因和异源核酸至细胞和受试者的有效方法的发展一直是可能治疗疾病和病症的目标。

复制型逆转录病毒载体(RRV；又名具有复制能力的逆转录病毒)已被用于选择性地感染动物模型的肿瘤(Wang et al.,Hum.Gene.Ther.,14:117-127,2003,Tai et al.,Mol Ther,12:842-851,2005),其中通过肿瘤发生复制。对于转基因表达的常规策略一直使用IRES元件，以允许翻译从内部核糖体结合位点开始。在大小受限的载体中，该IRES组件约600bp，离编码序列大约900bp。如果该载体配备了前药活化基因如由内部IRES序列表达的胞嘧啶脱氨酶或嘌呤核苷酸磷酸化酶，则通过前药(例如，5-氟胞嘧啶，其由胞嘧啶脱氨酶原位转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶)的后续处理，肿瘤可以被消除或生长/扩散被抑制(Tai et al.,Mol Ther.,12:117-127,2005,Ostertag et al.,Neuro Oncol.,2012)。这样的载体现在被用于临床实验治疗原发性脑肿瘤(参见万维网clinicaltrials.gov，NCT01156584)。然而，当总的插入大小超过约1.5kb时，这种RRV的遗传稳定性显著降低，致使若干潜在有用的基因或基因组合物对于简单可靠的治疗应用不能保证足够稳定。具体的例子是源于疱疹胸苷激酶(HSVtk)(SEQ ID NO：35)的常用前药激活基因，可以通过原位磷酸化激活常见的抗疱疹药物如更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦(Valtrex^TM)或其它类似物，导致细胞杀伤。HSVtk基因具有正好超过1.1kb的编码序列，当与IRES组合在一些表达构建体中使用时，形成大于约1.6kb的插入序列。这个大小对于临床使用是不够稳定的。另一例子是胞嘧啶脱氨酶基因(SEQ ID NO：1或3)与UPRT基因(SEQ ID NO：7)或OPRT基因(WO2010036986,Perez et al.,Mol.Ther.,2005)的组合，其中这些融合基因大约1200bp。虽然缺失发生之前的表达是令人满意的，但是与IRES组合时大小超过1.8kb并表现出不期望的不稳定性。

Logg等人(PNAS,105(12):4733-4738,2008)尝试过各种较短序列的IRES构建体，以改善整合至RRV中的外源基因大小，仅获得了有限的成功。具体地讲，Logg等人证明可以得到表达，但是由于IRES具有的剪接供体/受体作用较小的性质，其稳定性被降低。

发明简述

本公开提供了允许复制型载体中总体大小超过约0.9kb的基因或多个基因在体内稳定表达的方法和组合物。本公开提供了包含至少一个小型启动子盒的载体，其能够表达大于1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，或1.9kb的异源基因。如果考虑的治疗盒是多个小型启动子盒，或者单一小型启动子盒与包含可操作地连接至第二治疗分子的polIII启动子或IRES的第二盒，则整个治疗盒可包含约1.2-2.0kb。例如，当治疗盒中存在两个小型启动子盒时，第一小型盒可以表达第一基因或治疗性分子，而第二盒可以表达第二基因或治疗性分子。