[发明专利]生产免疫偶联物的方法

权利要求书

1.一种制备活性免疫偶联物的方法，其中所述免疫偶联物在一个或多个残基处脱酰胺化，其中所述脱酰胺化作用导致所述免疫偶联物效力的抑制，所述免疫偶联物由通过二硫键连接的两个多肽链组成，该方法包括在分批进料再折叠过程中在具有9.5或更小的pH的再折叠缓冲液中再折叠所述免疫偶联物，并且使用双循环洗脱在阴离子交换柱上纯化该再折叠的免疫偶联物，其中该柱在第一次洗脱和第二次洗脱之间利用包含乙醇胺、精氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、尿素以及二硫苏糖醇(DTT)的剥离缓冲液来剥离，所述免疫偶联物是包含SEQ ID NO:1的VH-PE38亚单位以及SEQ ID NO:2的VL亚单位的Moxetumomab pasudotox免疫毒素。

2.如权利要求1所述的方法，其中从该制备方法回收的免疫偶联物的量比利用不包括分批进料再折叠过程和/或在已使用该剥离缓冲液剥离的离子交换柱上的纯化的方法所回收的免疫偶联物的量大至少三百％(300％)。

3.如权利要求2所述的方法，其中该免疫偶联物包含抗体或其抗原结合片段。

4.如权利要求3所述的方法，其中该抗体或抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、双硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab')3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单一结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb²、(scFv)₂、或scFv-Fc。

5.如权利要求2所述的方法，其中该免疫偶联物包含毒素。

6.如权利要求5所述的方法，其中该毒素是绿脓杆菌外毒素或其变体。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述绿脓杆菌外毒素或其变体具有选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16至22。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述绿脓杆菌外毒素或其变体具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

9.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL序列。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述VH序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:6至11。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述VL序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:2、以及12至15。

12.如权利要求2所述的方法，其中该免疫偶联物包含抗CD22抗体或其抗原结合片段以及PE或其变体。

13.如权利要求2所述的方法，其中该再折叠缓冲液具有9.4的pH。

14.如权利要求2所述的方法，其中该分批进料过程使用每小时每升再折叠缓冲液52mL溶解的包涵体至每小时每升再折叠缓冲液13mL溶解的包涵体的添加速率。

15.如权利要求14所述的方法，其中该分批进料过程使用每小时每升再折叠缓冲液35mL溶解的包涵体至每小时每升再折叠缓冲液17mL溶解的包涵体的添加速率。

16.如权利要求15所述的方法，其中该分批进料过程使用每小时每升再折叠缓冲液30mL溶解的包涵体至每小时每升再折叠缓冲液18mL溶解的包涵体的添加速率。

17.如权利要求16所述的方法，其中该分批进料过程使用每小时每升再折叠缓冲液26mL溶解的包涵体的添加速率。