[发明专利]改进过表达碱性磷酸酶的酿酒酵母重组菌株中乙醇产率并减少生物质积累

说明书

在此描述了一种方法，该方法在酒精发酵过程中通过表达编码液泡或细胞溶质形式的碱性磷酸酶的截短形式的酿酒酵母PHO8基因增加乙醇产率，其表达降低了生物质积累同时将较大的碳转移给乙醇生产。还描述了用于表达该PHO8基因的核酸序列和载体以及运载它们的菌株。包含编码液泡形式的碱性磷酸酶的完整PHO8基因的菌株已经轻微地降低细胞内的ATP水平，其中生物质积累改变不显著并且乙醇生产增加高达13％。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月20日提交的美国临时专利申请号61/739,904的优先权。

技术领域

本发明涉及通过发酵生产乙醇的领域，并且更具体地说涉及在酿酒酵母中表达碱性磷酸酶e基因以改进乙醇的生产同时减少生物质积累。

发明背景

酒精发酵表示了在工业生物技术的领域中的酿酒酵母的最大应用，其中在2011年超过800亿升的燃料、工业和饮料乙醇的生产。在过去的十年并且由于经济和环境原因，世界范围内的燃料乙醇的生产已经经历了指数式增长(Schubert，2006)。虽然木质纤维素被认为是用于生产燃料乙醇最有希望的原料之一，但是目前燃料乙醇的工业生产严重依赖于传统原料(如，蔗糖(主要衍生自甘蔗或甜糖用甜菜)和从含淀粉材料获得的葡萄糖(玉米、小麦、大麦、马铃薯等))的发酵。目前用于生物乙醇生产的最常见的生物是面包酵母、酿酒酵母。这种酵母菌通过糖酵解恩布顿-迈耶霍夫途径(EMP)途径分解代谢葡萄糖产生2摩尔ATP/摩尔消耗的葡萄糖。这种途径在酵母菌中的效率是低的，其中最大的生物质产率约7％并且乙醇产率在理论值的90％与93％的范围内(Ingledew，1999)。然而，转化为细胞物质的7％的糖的工业规模代表巨大量的副产品，虽然这些副产品作为动物饲料是有价值的但是显著地降低目标产品乙醇的总产率。即使通过酿酒酵母在乙醇产率上的轻微的改进，每年乙醇生产的全球产量可以增加几百万l升乙醇。

与酿酒酵母相对比，细菌运动发酵单胞菌通过恩特纳-道德洛夫(ED)途径发酵葡萄糖。这个途径给出了仅仅1摩尔ATP/摩尔葡萄糖，并且将仅仅3％的葡萄糖引导至细胞生物质中实现了高达97％的可能的理论值的乙醇产率(Sprenger，1996)。这表明了在酒精发酵过程中降低ATP产率水平增加了乙醇产率，其中底物向细胞物质的转化降低。此外，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)具有超过酿酒酵母的另一个重要的优点：将葡萄糖更快的发酵成乙醇(Sprenger，1996，Panesar等人，2006)，运动发酵单胞菌的较高的繁殖力(productivity)通常归因于较快的糖摄取速率以及随后的分解代谢而不是低ATP产率。以用于生产工业乙醇的运动发酵单胞菌取代酿酒酵母的尝试被认为增加了3％-4％的乙醇产率，由此全世界每年增加了几亿升。然而，运动发酵单胞菌具有几个妨碍其工业用途的严重的缺点，并且这些缺点由以下各项组成：(i)非常狭窄的底物范围(蔗糖几乎不发酵，具有低的产率)，(ii)赖氨酸、蛋氨酸和一些维生素的天然营养缺陷体，(iii)非GRAS的状态，其阻止了作为饲料添加剂的生物质的使用，(iv)用于生长的较高的pH的需要(Jeffries，2005；Bai等人，2008；阿巴斯，未公开出版的发现)。此外，用于酒精发酵的酵母菌细胞的技术很好地发展，然而用于乙醇生产的细菌细胞的使用是很不常见的。因此，一种增加乙醇产率并且减少细胞物质生产的更好的方法是构建在酒精发酵过程中产生更少的ATP(例如，一摩尔ATP，如运动发酵单胞菌在ED途径中产生的)的酵母菌菌株。这些新的酵母菌菌株将酵母菌的所有的可能的优点与运动发酵单胞菌的高的乙醇产率结合。存在几种可以用于实现这个目标的方法，例如：由来自拥有该途径的基因的运动发酵单胞菌或其他细菌的ED途径取代酵母菌中的EMP途径；增加在无效循环的产生中所涉及的酶的活性；构建具有提高的ATP酶活性的重组菌株；并且引入编码质膜同向转运体的异源基因。