[发明专利]基因沉默

说明书

相关申请的交叉参考

本申请主张2012年12月18日提交的美国临时专利申请61/738,651的优先权。这个申请在此并入作参考。

序列提交

电子形式序列表与本申请一起提交。序列表的题目为2312128PCTSequenceListing.txt，在2013年12月5日建立，大小为27kb。电子形式序列表中的信息以其全部内容并入作参考。

发明背景

本发明涉及植物、植物组织和植物细胞中内源基因(endogene)的转录基因沉默(TGS)。更特别地，本发明涉及能通过TGS在植物、植物组织和植物细胞中更有效地沉默感兴趣基因如内源基因的核酸构建体。本发明进一步涉及使用本发明的核酸构建体，通过TGS在植物、植物组织或植物细胞中更有效地降低内源基因表达的方法。

本文中用于阐明本发明的背景或者提供关于实施的其它详细描述的出版物或其它材料均并入做参考，方便起见在参考文献中分别归类。

在十多年之前，Matzke及其同事报道了植物中转基因启动子(NOS)的转录基因沉默(TGS)与启动子DNA的甲基化之间的关系(Matzke et al.,1989)。自此，对植物中潜在的TGS机制在单子叶植物和双子叶植物中针对转基因和内源基因进行了广泛研究(参见(Matzke and Matzke,2004；Eamens et al.,2008；Matzke et al.,2009))。目前对TGS的研究提示通过双链RNA加工机制(AGO4，DCL3)产生的21-24nt小RNAs(sRNAs)靶向具有序列同源性的基因组区域。这些sRNA通过DNA甲基转移酶(DRM1/2，MET1，CMT3)的作用指导DNA甲基化，并推测这随后是涉及组蛋白甲基转移酶和去乙酰酶的组蛋白修饰，以建立在甲基化基因座的抑制性染色质状态。

使用转基因作为模型系统的早期研究揭示了植物中TGS相关的一些基本特征(Mette et al.,2000；Jones et al.,2001；Sijen et al.,2001)。这些研究表明长发夹结构为产生靶向转基因启动子的sRNA所需。对沉默的转基因的DNA分析证实对称和不对称的胞嘧啶甲基化均增加，并且MET1参与沉默基因座的维持。相似地，长反向重复(IR)也已经证实介导水稻中35S启动子的有效TGS(Okano et al.,2008)。显然，有义(S)或反义(AS)方向的单链沉默子不能在烟草和拟南芥中有效产生sRNA及产生TGS(Mette et al.,2000)。

尽管关于转基因的TGS的事件顺序相对充分明确，但是还未知相似的步骤是否也用于内源基因座(后文称作内源基因)的TGS。令人惊奇地，迄今为止仅报道了少数内源基因座的TGS，均是使用IR RNA。Cigan et al.(2005)报道成功和强力地沉默两个玉米内源基因(Cigan et al.,2005)。在矮牵牛花、马铃薯和水稻中针对一些内源基因观测到中等沉默(Sijen et al.,2001；Heilersig et al.,2006；Okano et al.,2008)。IR RNA触发内源基因TGS的无效性在使用单子叶水稻模型的综合研究中得到充分例证。感兴趣地，在水稻中检验的7个内源基因中有6个示出对通过从IR RNA结构中产生的sRNA所致沉默是抗拒的(Okano et al.,2008)。相反，在相同的实验中，示出35S启动子可以被靶向这个启动子的IR RNA有效沉默。其它不成功的试验(八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和查耳酮合成酶(CHS))也已经在拟南芥中报道(Eamens et al.,2008)。总之，这些结果提示内源性基因座也许具有可阻止意外的TGS的一些固有性质；或者，需要探究针对内源性基因座的更有效的沉默策略。除了观测到的在内源基因座的基因沉默的低成功率，也存在针对内源基因的TGS与DNA甲基化之间以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的差异(Okano et al.,2008)。在水稻中大多数情况，靶向启动子区域的IRRNA可以触发同源序列的DNA甲基化，但是其不能诱导染色质修饰和TGS(Okano et al.,2008)。

希望开发增强植物中转录基因沉默的核酸构建体和方法。

发明概述