[发明专利]RNA-引导的人类基因组工程化

说明书

相关申请数据

本申请要求于2013年3月13日提交的美国临时申请号61/779,169和2012年12月17日提交的美国临时申请号61/738,355的优先权，通过引用将其全部内容结合在此用于所有目的。

政府权益声明

在国立卫生研究院授予的P50HG005550下用政府支持完成本发明。政府对本发明拥有某些权利。

背景技术

细菌和古细菌的CRISPR系统依赖于与Cas蛋白复合的crRNA以直接降解在入侵的病毒和质粒DNA(1-3)内的互补序列。酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统最近的体外重构表明正常地反式编码的tracrRNA融合的crRNA足以指导Cas9蛋白序列特异性地切割匹配crRNA的靶向DNA序列(4)。

发明内容

本公开用数字引用文献，文献列在本公开的最后。对应于数字的文献通过引用结合至本说明书中，作为对应于该数字相当于全部引用的支持引用。

根据本公开的一个方面，用包括与基因组DNA互补的RNA和与该RNA相互作用的酶的双组分系统转染真核细胞。由细胞表达该RNA和该酶。RNA/酶复合物的RNA随后结合至互补的基因组DNA。酶随后执行功能，如基因组DNA的切割。该RNA包括约10个核苷酸至约250个核苷酸之间。RNA包括约20个核苷酸至约100个核苷酸之间。根据某些方面，酶可以以位点特异性的方式执行任何希望的功能，对于该功能酶已经被工程化。根据一个方面，真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。根据一个方面，酶切割由RNA序列靶向的基因组序列(参见参考文献(4-6))，从而产生基因组改变的真核细胞。

根据一个方面，本公开提供了一种通过将编码与基因组DNA互补的RNA的核酸包括进入细胞的基因组以及将编码在基因组DNA上执行希望的功能的酶的核酸包括进入细胞的基因组来遗传改变人类细胞的方法。根据一个方面，表达RNA和酶。根据一个方面，RNA与互补的基因组DNA杂交。根据一个方面，当RNA与互补的基因组DNA杂交时，酶被激活来以位点特异性方式执行希望的功能，如切割。根据一个方面，RNA和酶是细菌II型CRISPR系统的组分。

根据一个方面，提供了一种改变真核细胞的方法，包括用编码与真核细胞的基因组DNA互补的RNA的核酸转染真核细胞，用编码与RNA相互作用并且以位点特异性方式切割基因组DNA的酶的核酸转染真核细胞，其中，细胞表达该RNA和该酶，该RNA结合于互补的基因组DNA并且该酶以位点特异性方式切割基因组DNA。根据一个方面，该酶是Cas9或修饰的Cas9或Cas9的同源物。根据一个方面，真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。根据一个方面，RNA包括约10至约250个核苷酸。根据一个方面，RNA包括约20至约100个核苷酸。

根据一个方面，提供了一种改变人类细胞的方法，包括用编码与真核细胞的基因组DNA互补的RNA的核酸转染人类细胞，用编码与RNA相互作用并且以位点特异性方式切割基因组DNA的酶的核酸转染人类细胞，其中，人类细胞表达该RNA和该酶，该RNA结合于互补的基因组DNA并且该酶以位点特异性方式切割基因组DNA。根据一个方面，该酶是Cas9或修饰的Cas9或Cas9的同源物。根据一个方面，RNA包括约10至约250个核苷酸。根据一个方面，RNA包括约20至约100个核苷酸。

根据一个方面，提供了一种在多个基因组DNA位点处改变真核细胞的方法，包括用编码与真核细胞基因组DNA上不同位点互补的RNA的多个核酸转染真核细胞，用编码与RNA相互作用并且以位点特异性方式切割基因组DNA的酶的核酸转染真核细胞，其中，细胞表达该RNA和该酶，该RNA结合于互补的基因组DNA并且该酶以位点特异性方式切割基因组DNA。根据一个方面，该酶是Cas9。根据一个方面，该真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。根据一个方面，该RNA包括约10至约250个核苷酸。根据一个方面，该RNA包括约20至约100个核苷酸。

具体实施方式