[发明专利]使用HB9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法

说明书

本发明提供了促进多能干细胞分化成表达PDX1、NKX6.1和HB9的胰腺内胚层细胞的方法。具体地，所述方法涵盖用甲状腺激素(例如T3)、ALK5抑制剂、或甲状腺激素和ALK5抑制剂两者培养第四阶段至第六阶段的细胞。

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请61/747,672(2012年12月31日提交)的优先权，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明所属领域为细胞分化领域。更具体地，本发明涉及将特定的甲状腺激素或其类似物、和ALK5抑制剂用作胰腺内胚层和内分泌细胞的HB9调节子。

背景技术

I型糖尿病的细胞替代疗法在不断推进，同时可移植胰岛又一直短缺，这使人们重点着眼于扩大适于移植产胰岛素细胞(即β细胞)的来源。一种方法是由多能干细胞(例如胚胎干细胞)产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育期间，多能细胞在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层经由中间阶段发育产生。原肠胚形成的中间阶段涉及形成定形内胚层。

到原肠胚形成结束时，内胚层分裂成了前、中、后三个区域，可通过检测一组独特标记内胚层这三个区域的因子的表达水平来识别这些区域。例如，HHEX和SOX2是内胚层前区的独特标记物；而CDX1、CDX2和CDX4是内胚层后区的独特标记物。

内胚层组织迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密靠近，从而有助于肠管分区。肠管分区在多种分泌因子例如FGF、WNT、TGF-β、视黄酸(RA)、BMP配体和它们的拮抗物的作用下实现。例如，FGF4和BMP促进预定后肠内胚层中的CDX2表达并阻遏前基因HHEX和SOX2的表达(2000 Development，127：1563-1567)。还证明了WNT信号转导与FGF信号转导并存，能够刺激后肠发育并控制前肠命运(2007 Development，134：2207-2217)。最后，间充质分泌的视黄酸调节前肠与后肠的边界(2002 Curr Biol，12：1215-1220)。

可利用特异性转录因子的表达水平来判断组织的种类。在定形内胚层转化为原肠管期间，肠管在大范围内逐渐分区，形成多个区域。技术人员可通过识别这些区域的有限基因表达模式，在分子水平上观察到这些区域。肠管中分区的胰腺域显示出PDX1有极高表达，但CDX2和SOX2的表达却非常低。PDX1、NKX6.1、PTFlA和NKX2.2在胰腺组织内高度表达，CDX2在肠组织内高度表达。

胰腺形成源于定形内胚层分化成胰腺内胚层。背侧和腹侧胰腺域衍生自前肠上皮组织。前肠还会分化成食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝和胆管系统。

胰腺内胚层细胞会表达胰十二指肠同源盒基因PDX1。没有PDX1时，胰腺在形成腹胰芽和背胰芽后便不再发育。因而，PDX1表达是胰腺器官形成中至关重要的一步。成熟胰腺由胰腺内胚层分化产生的外分泌组织和内分泌组织构成。

D’Amour等人描述了向人胚胎干细胞的培养基中加入高浓度活化素和少量血清，由此制得源于人胚胎干细胞的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005，23：1534-1541；美国专利7,704,738)。据报道，在把这些定形内胚层细胞移植到小鼠的肾包膜下之后，这些细胞会分化成具有内胚层组织特征的更成熟细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF10和视黄酸后，这些衍生自人胚胎干细胞的定形内胚层细胞还可进一步分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554)。接下来将这些胰腺前体细胞移植到免疫缺陷小鼠的脂肪垫中，在三至四个月的成熟期后，便得到了功能性胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。