[发明专利]熔解曲线分析

说明书

提供一种用于利用荧光表征具有独特的T_m的诸如PCR产物的核酸分子的高分辨率率熔解曲线分析的方法。所述技术包括将原始熔解曲线数据建模称为至少两个信号分量的总和，第一信号分量表示由未结合/自由荧光基团发射的高强度，并且一个或多个第二信号分量表示由结合到双链DNA的荧光基团发射的组合光强度。数值分析被用来确定有助于总信号的不同分量的值，使得模型尽可能严密地匹配原始荧光数据。该方法使得即使在非饱和燃料浓度下仍能够提高靶合适的混合物的分辨率，因为考虑到从低温双链到在较高温度下熔解的双链的插入染料的再分配效果。

发明领域

本发明涉及熔解曲线分析。具体地，本发明涉及一种方法，一种装置和一种用于分析熔解曲线数据的信号描述的计算机程序。

发明背景

熔解曲线分析和高分辨率熔解(HRM)分析通常是用于检测和分析样品中的核酸序列的存在的方法。通常在核酸的PCR扩增后，正常立即进行分析，并且该分析依赖于作为温度函数的反应溶液监测荧光。所使用的荧光分子可以是双链DNA结合的荧光基团或荧光标记探针。

通常情况下，对于成功的HRM分析，需要几乎完全饱和的双链DNA结合荧光基团。这一要求限制了可能的荧光基团的选择，因为其中它们中的许多将需要过高的浓度，而不允许有效扩增。

传统的HRM分析不是很好地适于进行定量分析。例如，在某些情况下，能够定量评估在多相样品中的突变序列的相对丰度将是有益的。这种类型的信息例如在与癌症和非整倍体分析相关的所获得单核苷酸多态性(SNP)分析中是有价值的。

此外，传统的HRM分辨能力限制了它例如在检测纯合子SNP突变体中的使用，因为熔解温度的差异是次要的。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种分析技术，其适合核酸分子的定量分析，并能够以良好的分辨率(在熔解温度差异方面)进行样品中核酸的检测和/或识别。

本发明的目的是通过如由相应的独立权利要求所限定的方法、装置和计算机程序实现的。

在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线(melt curve)的新颖方法，其表征溶液的熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所述方法包括：获得在一定温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述荧光基团发射的作为温度的函数的光强度；在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建模成为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率；和利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得荧光信号和模型化荧光信号之间的差满足预定标准。

该方法可以包括将所述第三项的每一个建模成为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用水平的描述，其是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数，其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核酸分子种群的熔解概率的描述，其是温度的函数，并且其中确定所述第三项的每个的值包括确定所述第一和第二参数函数的参数值。