[发明专利]一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用。

背景技术

目前从国产眼镜蛇科眼镜王蛇中首次分离得到了蛇毒Kunitz-型蛋白酶抑制剂OH-TCI，是目前自然界发现的唯一同时具有胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制活性且对二者抑制活性基本相同的Kunitz-家族成员。OH-TCI与抑肽酶Aprotinin同属Knitz-型蛋白酶抑制剂，二者的成熟肽均由58个氨基酸残基组成。但二者胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性有明显的差异。抑肽酶（Aprotinin）是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抑制纤溶酶、激肽释放酶和保护血小板的作用。在临床上，主要用于治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量。

OH-TCI是从眼睛王蛇蛇毒少量提取获得。由于其来源困难，不能进行工业化生产，采取DNA重组技术生产蛋白酶抑制剂OH-TCI是解决其供需矛盾的有效途径。

发明内容

本发明针对现有技术中利用大肠杆菌表达系统生产眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI所存在的外源蛋白的表达在细胞周质空间、翻译后加工不理想、产量低的不足，提供了一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI及其表达方法和应用。本发明采用大肠杆菌表达系统可以获得高表达量、高活性的rOH-TCI，不受原材料来源的限制，克服了以其他方式获取OH-TCI的成本高、表达量低和活性低的缺点。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种优化的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

克隆所述基因的特异性引物为：

引物F1：5’-ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’；

引物R1：5’-ACGCGGCCGCTTAACCACCACCACCACCAA-3’。

在所述OH-TCI基因的5’端加有SmaI酶切位点，3’端加有HandIII酶切位点。

本发明还提供了所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI编码产生的蛋白酶抑制剂OH-TCI，其具有序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

含有所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI的重组载体，所述重组载体为pUC18-OH-TCI和pET43.1-OH-TCI。

本发明还提供了所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI在在制备治疗急性胰腺炎和减少术中的出血量的药物或保健品中的应用。所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂OH-TCI具有对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性。

本发明选择眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI，根据大肠杆菌密码子的偏好性对基因序列进行优化，并人工合成优化后的OH-TCI基因，将其与pUC18-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒pUC18-OH-TCI，以重组质粒pUC18-OH-TCI为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增得到目的基因片段OH-TCI。将合成的优化后的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因OH-TCI与载体pET43.1a连接，构建了重组质粒pET43.1-OH-TCI。将重组质粒pET43.1-OH-TCI经化学转化法转到大肠杆菌BL21中，在含抗生素Ampicillin筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于LB液体培养基中，将菌株按2%接种量接入LB培养基中，于37℃，210r/min摇床培养至OD600值达到0.5-0.6时，加IPTG，28℃温度下诱导表达，同时进行最佳诱导表达条件的探索，以确定表达的最佳条件。诱导结束后，离心收集菌体细胞。超声破碎，离心。菌体裂解物上清进行SDS-PAGE，得到与预期一致大小约为73kD的目的条带。Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白NusA-OH-TCI；融合蛋白NusA-OH-TCI连接处设计有thrombin的酶切位点，用thrombin酶切融合蛋白，通过HPLC方法制备重组rOH-TCI。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定重组rOH-TCI的分子量。由于thrombin酶切，在重组rOH-TCI的N端残留两个氨基酸Gly-Ser，结果表明，重组蛋白rOH-TCI蛋白分子量与理论基本一致（6490.40Da）。重组rOH-TCI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶具有明显抑制活性。