[发明专利]一种双基因microRNA荧光定量内参及其引物在贝类组织样品中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说是一种适用于在贝类组织样品中进行microRNA(miRNA)表达分析的双基因miRNA定量内参及其引物。

背景技术

贝类，属软体动物门中的瓣鳃纲(或双壳纲)，常见的种类有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。现存种类1万种左右，其中80％生活于海洋中。贝类中绝大多数种均可食用，很多贝类的肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。

MicroRNA是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链RNA，长约21～24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mRNA来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性，近几年国内外科学家对miRNA的研究倍加重视。对贝类miRNA的研究有助于推动贝类养殖业的发展。贝类中只报导了65条miRNA(miRBase 20)，且暂时没有可用于miRNA定量的内参基因报导。

目前对miRNA的表达分析主要有大规模测序，基因芯片和实时荧光定量法。大规模测序和基因芯片法为高通量方法，成本很高，不适于少量miRNA的功能分析。而基于SYBR Green染料荧光定量PCR的miRNA相对定量法，参见文献：【Shi R，Chiang VL(2005)Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR.Biotechniques 2550 39：519-525.】有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。而在相对法荧光定量PCR中，内参的选择尤为重要。由于在不同的样品中small RNA(＜200nt)与总RNA比例有差异，small RNA的提取效率与长的RNA不同等原因，miRNA表达分析所用内参推荐使用与miRNA片段大小相当的miRNA或者snRNA等作为内参。本发明的目的是提供一种适用于在贝类组织样品中进行microRNA表达分析的定量内参。

发明内容

本发明的目的是提供一种双基因microRNA荧光定量内参及其引物在贝类组织样品中的应用。即，一种基于荧光定量PCR中的相对定量法在贝类组织样品中进行microRNA的定量分析所用的双基因microRNA荧光定量内参基因(let-7和miR-87)及其引物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种双基因microRNA荧光定量内参及其引物在贝类组织样品中的应用：双基因microRNA荧光定量内参中的两个贝类基因为let-7具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列和miR-87具有序列表SEQ ID No：2中碱基序列。

所述两个贝类基因let-7和miR-87在贝类的不同组织样品中稳定表达(即，表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。

同时使用两个稳定表达的microRNA作为双基因内参；双基因内参的表达量Ct值为，let-7和miR-87基因在某组织样品中的表达量Ct值的算术平均数；通过该双基因内参校正上样过程中的实验误差，能够提高实验的准确性。

根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所用内参基因let-7的特异性引物为：5’-GGGTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’；miR-87的特异性引物为：5’-GGTGAGCAAAGTTTCAGGTGTGT-3’。

具体步骤为：

a.候选miRNA序列的获得：从已有数据库或其它来源(如数据库网站miRBase，高通量测序等)获得欲做表达分析的miRNA序列。

b.引物设计：根据获得的候选miRNA序列设计该miRNA相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3％的琼脂糖胶检测条带单一)。

c.PCR模板的准备：收集样品后，用TRIzol(试剂，市购于Invitrogen公司)提取总RNA，用One Step PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit(试剂盒，市购于TaKaRa公司)按照说明书加polyA尾后反转成cDNA。作为荧光定量PCR的模板。