[发明专利]用于储存和运输NK-92细胞系的方案和培养基

说明书

技术领域

本发明涉及NK-92细胞的储存和运输，使得所述细胞保持存活以用于施用给患者，例如，在放入储存培养基中以后存活至少24小时的时段。

背景技术

免疫系统的某些细胞对特定靶细胞具有细胞毒性活性。天然杀伤(NK)细胞（通常占循环淋巴细胞的约10-15%）会结合和杀死靶细胞，包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞，就抗原而言是非特异性的，且没有先前免疫致敏。Herberman等人,Science214:24(1981)。靶细胞的杀死通过诱导细胞裂解而发生。已经证实，NK细胞在具有晚期癌症的患者的离体疗法和体内治疗中都是有效的。但是，内源NK细胞(即，从供体或从患者收获的那些)仍然难以起作用和应用于免疫疗法。难以离体繁殖维持它们的体内靶向肿瘤能力、杀肿瘤能力和杀病毒能力的NK细胞，这是它们在过继细胞免疫疗法中的临床应用的主要障碍。Melder,等人,Cancer Research48:3461-3469(1988);Stephen,等人,Leuk.Lymphoma377-399(1992);Rosenberg,等人,New Engl.J.Med.316:889-897(1987)。此外，内源NK细胞的制品包括，如果使用NK细胞来治疗与供体无关的患者则必须除去的T细胞和/或其它免疫效应细胞。

本文中描述的实施方案一般地涉及用于运输和/或递送NK-92细胞的储存培养基，以及涉及运输和使用运输的NK-92细胞的方法。

发明内容

NK-92细胞系是一种被发现在有白介素2(IL-2)存在下会繁殖的独特细胞系。Gong等人,Leukemia8:652-658(1994)。这些细胞对多种癌症具有高细胞裂解活性。NK-92细胞系是具有宽抗肿瘤细胞毒性的均匀NK细胞群体，在繁殖以后具有可预测的产率。I期临床试验已经证实了它的安全性谱，并且已经观察到在某些具有晚期癌症的患者中的抗肿瘤应答。

用NK-92细胞治疗患者的一种限制是，在长时间段内储存和/或运输所述细胞的能力。在患者疗法中使用的NK细胞必须维持在当前良好制备规程(cGMP)下，由此限制可以培养和制备NK-92细胞系的场所的数目。迄今为止，NK-92细胞在患者疗法中的应用已经受限于非常邻近要在其中进行治疗的医院的培养和生产场所的可用性；现在在邻近医院的场所中制备NK-92细胞，然后携带至医疗队用于治疗患者。目前，冷冻的NK-92细胞在解冻后表现出急剧下降的细胞毒性。即使在几天的培养恢复期以后，NK-92细胞数目和细胞毒性仍然是次优的。

迄今，对内源NK细胞的研究已经指示，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中的NK细胞活化是至关重要的，但是所述细胞不需要维持在37℃和5%二氧化碳下。Koepsell,等人,Transfusion53:398-403(2013)。但是，内源NK细胞显著不同于NK-92细胞，这主要是由于它们的不同起源：NK-92是癌症衍生的细胞系，而内源NK细胞收获自供体(或患者)并在加工后用于输注进患者中。内源NK细胞制品似乎异质细胞群体，而NK-92细胞是均匀的克隆细胞系。NK-92细胞在维持细胞毒性的同时可容易地培养繁殖，而内源NK细胞却不能。另外，内源NK细胞的异质群体不会以高密度聚集。因此，在储存和/或运输这2种细胞类型以后，生存力和细胞毒性的最大化需要非常不同的考虑。

NK-92细胞存在其它问题。例如，NK-92需要IL-2的存在才能保持存活和繁殖，并且会在少至1IU/mL的IL-2中繁殖。Gong,等人.出处同上。此外，细胞形态学和/或表型随着在培养基中使用的IL-2的量而变化。Gong,等人.出处同上。例如，IL-2受体(CD-25)表达与IL-2浓度成反比。Gong,等人.出处同上。

更进一步，在高浓度的NK-92细胞聚集会消极地影响它们在治疗患者中的应用。这会产生困难，因为在没有IL-2存在下，NK-92细胞会丧失生存力，而在有IL-2存在下，所述细胞会繁殖。实际上，在正常细胞培养条件下，NK-92细胞的数目在约26-32小时内倍增。该困难被下述事实进一步复杂化：储存培养基必须能够允许在NK-92细胞放入储存培养基中以后多达至少24小时内运输至医院。为了防止在运输过程中的聚集，必须考虑在任何给定IL-2浓度下的NK-92细胞增殖速率。