[发明专利]在禽类中进行转基因表达

说明书

本申请是申请日为2007年10月29日、申请号为200780049954.X、发明名称为“在禽类中进行转基因表达”的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请信息

本申请要求享有2007年5月16日提交的美国临时申请号60／930,491和2007年9月18日提交的美国临时申请号60／994,203的优先权，并作为2007年1月26日提交的美国专利申请号11／699,257的连续部分。上述两个临时申请和一个专利申请中每一个的内容整体纳入本文作为参考文献。

发明范围

本发明一般涉及在诸如转基因鸡的转基因禽类细胞(如输卵管细胞)发挥功能的启动子和含此类启动子载体的用途。更具体的说，本发明涉及重组核酸和表达载体，转染细胞和转基因动物，例如含有与编码序列可操作连接的基因表达控制区的载体的转基因鸡等转基因禽类。

背景

最初转基因学领域发展用于了解单个基因在整体动物条件下的作用，以及基因激活、表达和相互作用的现象。转基因技术也用于在产生人或其它动物疾病模型，在遗传学研究、了解遗传机制和功能的有力工具之一。从经济的角度，使用转基因技术将动物转变为“蛋白工厂”用于产生药学感兴趣的特定蛋白或其它物质(Gordon等，1987年，Biotechnology5：1183-1187；Wilmut等，1990，Theriogenology33：113-123)比常规用于蛋白生产的基因表达技术提供了更显著的优势。

一种用于表达外源蛋白的系统是禽类生殖系统。禽类卵的产生开始于在雌鸟的卵巢中形成大的卵黄。未受精的卵母细胞或卵子位于卵黄囊的上部。排卵后，卵子穿过输卵管的漏斗，在此若存在精子则使其受精，接着穿过管状腺体细胞排列成的输卵管分泌部。这些细胞分泌卵白蛋白，包括卵清蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白、伴清蛋白和卵粘蛋白进入分泌部内腔，在此在禽胚和卵黄上沉积。过去曾在禽类生殖系统进行特定靶向禽输卵管的外源蛋白的产生。

靶向禽输卵管表达外源蛋白的优势包括靶蛋白正确的折叠和翻译后修饰，易于回收产物，与其它动物种属相比鸟类如鸡的发育期较短。

在转基因禽类的输卵管内直接表达外源基因产物比在鸟体内广泛表达具有显著的优势。即，不期望在宿主动物体内广泛表达生物活性基因产物的结果。例如，在某些情况下重组蛋白的广泛存在对于鸟类发育有害，杀死鸟类。此外，鸟类的健康受到负面影响导致蛋白生产水平的降低。

在重量上，禽类卵的约60％由蛋白组成，其包括四种主要蛋白质组分；卵清蛋白、卵类粘蛋白、溶菌酶以及卵运铁蛋白，卵清蛋白和卵类粘蛋白大量存在。

过去已成功在转基因禽类的输卵管中使用卵清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子和溶菌酶启动子表达异源(外源性)蛋白质。参见，例如2005年4月5日发表的美国专利号6,875,588；2007年2月13日发表的7,176,300；2007年4月3日发表的7,199,279；以及2006年6月15日公开的美国专利公开号2006／0130170(该三种发表专利和一种公开专利申请的每一公开文本均整体纳入本文作参考)，其公开了主要或仅在禽输卵管中表达的不同禽类启动子利于在禽类输卵管外源蛋白质的产生。尽管这些发表的专利以及公开的申请中使用启动子以及启动子片段的表达水平是可用的，但其产量仍低于0.1mg/ml卵白。

需要在转基因禽类的细胞尤其是输卵管细胞(如管状腺体细胞)中高水平表达外源性编码序列的系统。

发明概述

本发明满足甚至超越这种需要。本发明的发明人经过数年在转基因禽类的输卵管组织中中等产量产生外源蛋白质，发现使用本文公开的新组合物和方法可使该表达水平提高约10倍到100倍甚至更高。

一个方面，本发明涉及转基因禽类(如鸡、火鸡、鹌鹑)，在其基因组中含有具有启动子组件和SIN载体的外源核苷酸序列。通常，启动子组件与禽外源性编码序列，即在禽体内通常或天然不存在的编码序列连接。通常，外源核苷酸序列整合入禽的基因组中。在一个尤其有用的实施方式中，所述启动子组件主要在禽类输卵管(如管状腺体细胞)中发挥功能或表达。例如，所述启动子组件可为输卵管特异性启动子。例如，所述启动子组件可为禽类卵类粘蛋白启动子、禽类卵清蛋白启动子、禽类溶菌酶启动子和禽类卵抑制剂组件(即伴清蛋白启动子组件)之一。

发明人已显示SIN载体对于增加在禽输卵管中外源蛋白的表达量尤其有用。当SIN载体也为SC负载体时(即载体不含具有功能性启动子的可选择标记盒)，这种效应可进一步增强。