[发明专利]高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法

权利要求书

1.一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法，其特征在于：本发明主要分为两个步骤，步骤一为腺病毒表达载体的构建，即采用AdMax腺病毒包装系统构建表达黑色素瘤分化相关基因－7（melanoma differentiation-associated gene 7 ，mda－7）的腺病毒表达载体Ad.mda-7.egfp，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy 系统，提高腺病毒出毒成功率；其主要方法为：将重组的含有目的基因mda-7片段的穿梭质粒载体pDC316- mda-7和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre，共同转染至HEK293细胞，包装产生重组腺病毒Ad.mda-7.egfp，并进行扩增及感染性滴度测定，步骤一主要为保证AdMax系统出毒成功率，即保证AdMax系统真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98%；步骤二为腺病毒表达载体的功能鉴定，即以Ad.egfp，Ad.mda-7.gfp为对照病毒，以支气管上皮细胞HBE为对照细胞，观察Ad.mda-7.egfp表达绿色荧光蛋白的效率及选择性诱导肺腺癌细胞A549调亡的效应；其主要方法为：（1）以Ad.mda-7.gfp为对照病毒，流式细胞仪检测Ad.mda-7.egfp及Ad.mda-7.gfp表达绿色荧光蛋白的效率；（2）以Ad.egfp为对照病毒， PI染色法检测Ad.mda-7.egfp诱导A549细胞凋亡的效应；（3）以支气管上皮细胞HBE为对照细胞，流式细胞仪检测Ad.mda-7.egfp选择性诱导肿瘤细胞凋亡。

2.如权利要求1所述的高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法，其特征在于：步骤一具体操作步骤为：

（1）重组腺病毒Ad. mda-7.egfp的包装；

用BglII和HindIII内切酶同时对腺病毒载体pDC316 -egfp和mda-7片段进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳回收；将回收的载体片段和目的基因cDNA 用T4 L igase 16⁰C连接过夜,直接取5μL连接产物转化TG1感受态细菌, 用含氨苄青霉素LB 培养基平板进行筛选, 挑出3个克隆, 摇菌过夜, 抽提质粒、双酶切鉴定正确的重组腺病毒穿梭载体命名为pDC316-mda-7.egfp；用质粒抽提试剂盒提取病毒包装系统中的质粒DNA，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度后进行质粒转染过程；将穿梭质粒pDC316-mda-7.egfp 和辅助质粒pBHGlox( delta) E1，3Cre 通过Lipofectamine 2000共转染HEK293 细胞，观察细胞生长状况，待大部分细胞出现细胞病变( cytopathic effect，CPE) ，收集细胞，－ 70 ⁰C /37 ⁰C反复冻融，收集病毒上清－ 70 ⁰C保存；

（2）重组腺病毒Ad. mda-7.egfp感染性滴度（TCID50）测定；

将生长状态良好的HEK293 细胞4 倍稀释后转入细胞培养瓶中，加入重组腺病毒Ad. mda-7.egfp收获的粗提液继续培养，待大部分细胞出现典型的CPE，收集病毒上清液，再次扩增，将混悬液3000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用Tris缓冲液重悬，反复冻融三次，6000rpm离心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45um的滤膜过滤，然后进行柱纯化；－70℃保存；在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-10；将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl；在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到3×10⁵个/ml；将96孔板置于37⁰C CO₂培养箱中培养，10 天后观察细胞病变现象，并对CPE 孔进行计数，计算每行的阳性率；病毒滴度计算按（Karber法）：滴度T＝10^{1+d（s-0.5）}进行；重组腺病毒Ad. mda-7.egfp， 病毒活性单位为2.5×10¹⁰IU/ml，而常用的AdEasy包装系统产生的病毒活性单位通常只有10⁷－10⁸ IU/ml ，AdMax系统包装的病毒活性明显高于AdEasy包装系统。

3.如权利要求1所述的高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法，其特征在于：步骤二具体操作步骤为：

（1）流式细胞仪检测Ad.mda-7.egfp表达绿色荧光蛋白的效率；

6孔板中肺癌细胞株A549和正常支气管上皮细胞株HBE细胞至30%满后，分成2组，分别加入Ad.mda-7.gfp(l0⁴vp/cell)，Ad.mda-7.egfp(l0⁴vp/cell)处理，48小时后分别用胰酶收获细胞，用PBS洗后调整细胞浓度为1x10⁶ml，加入结合缓冲液后取100ul，用流式细胞仪检测Ad.mda-7.egfp表达绿色荧光蛋白的效率；

 （2）Hoechst33342、PI双染法检测Ad.mda-7.egfp诱导A549细胞凋亡

在6孔板中接种肺癌细胞株A549，生长至40%满后，分成3组，对照组1和对照组2分别加入无血清1640，Ad.egfp (l0⁴vp /cell)，第三组加入Ad.mda-7.egfp(l0⁴vp /cell)处理，48小时后，反复PBS洗涤后加入终浓度5ug/ml的Hoechst33342，避光染色10分钟后加入终浓度为15ug/ml PI，避光染色10分钟后，Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，PI用氩离子激光激发荧光，结果判断：正常细胞为低蓝光/低红光，早期凋亡细胞为高蓝光/低红光，晚期凋亡细胞高蓝光/红光，坏死细胞为低蓝光/高红光；

（3）流式细胞仪检测Ad.mda-7.egfp选择性诱导肿瘤细胞凋亡；

6孔板中肺癌细胞株A549和正常支气管上皮细胞株HBE细胞至30%满后，分成3组，分别加入无血清1640，Ad.egfp (l0⁴vp/cell)，Ad.mda-7.egfp(l0⁴vp/cell)处理，48小时后分别用胰酶收获细胞，用PBS洗后调整细胞浓度为1x10⁶ml，加入结合缓冲液后取100ul，分别加入5ulIAnnexin-V和10ul PI染液，避光作用15min后用流式细胞仪检测。