[发明专利]高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒构建方法，尤其涉及一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法。

背景技术

常用腺病毒载体的包装方法包括： 1) 经典的同源重组法（双质粒共转染）：原理是同源重组。在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。2) Ad-Easy法：原理是通过同源臂重组的方式在细菌中获得重组腺病毒基因组质粒。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒共转化RecA+细菌，在细菌RecA重组酶的作用下经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其线性化后转染293细胞获得重组病毒。以上两种方法存在操作繁复，重组效率较低等缺陷，在实际的应用中受到了一定的限制。

黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7)是近年来发现的一种新型肿瘤抑制基因，现在又命名为IL-24。该基因能促进其他多种癌细胞的生长抑制和凋亡，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌等。相对于其它抗肿瘤基因，mda-7在抗瘤抑瘤及降低毒副作面用两具有明显的优势。首先，mda-7的抗肿瘤具备恶性肿瘤选择性。该基因对正常表皮细胞，肺成纤维细胞，乳腺细胞，前列腺和肺上皮细胞，星形胶质细胞，内皮细胞及黑色素细胞等正常细胞均无任何毒副作用；其次，mda-7用于癌症治疗不受肿瘤细胞的抑癌基因状态的影响，相对于p53等抑癌基因来说，mda - 7抑制癌细胞的增长和促进凋亡与这些癌细胞中其它抑癌基因的状态无关(p53，Rb，或pl6ink4)，因而可以更稳定地发挥抗肿瘤作用；同时，mda-7/IL-24是一个前Thl因子(pro－Thlcytokine)，能激活STAI产生肿瘤免疫，抗血管生成和受体介导的细胞毒性；最后，mda-7 蛋白还可以大大增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性, 从而起到杀伤肿瘤细胞的效果。mda-7是IL-10家族中唯一的具有杀死肿瘤细胞而对正常细胞没有任何毒性作用的细胞因子，从而具有极大的临床抗肿瘤应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效包装与表达黑色素瘤分化相关基因-7的腺病毒构建方法，克服现有技术腺病毒构建方法中存在的操作繁复，重组效率较低，抗肿瘤选择性差等缺陷。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一、本发明采用属于腺病毒AdMax^TM的pDC316为载体，以此构建重组腺病毒表达载体代替最普及的AdEasy 系统。与目前使用最普及的腺病毒AdEasy系统相比，腺病毒AdMax^TM系统具有操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于10⁴vp/cell）的特点。AdMax^TM系统只需要2－4周就能完成从质粒构建到重组出毒，AdMax系统因在真核细胞内重组出毒，出毒成功率大于98%(其中95%的克隆含有目的基因)，而AdEasy系统的出毒成功率只有18%－34%。AdMax^TM系统采用mCMV启动子，因为mCMV启动子比常用的hCMV启动子强若干倍，所以AdMax^TM系统包装的目的基因的表达水平明显提高3－4倍。二、本发明以AdMax^TM系统包装mda-7基因构建了复制缺陷型腺病毒载体Ad.mda-7. egfp，并证明其具有增强蛋白表达效率及选择性诱导肺腺癌细胞株A549凋亡的功能。腺病毒转染肺癌细胞A549和正常的支气管上皮细胞HBE后，将该基因转染入肺癌细胞后，能促进肺癌细胞的凋亡（F=6376.200,P〈0.001），而对正常支气管上皮细胞HBE则无明显作用（F=2.227,P=0.189），经Ad.mda-7.egfp干预后，两种细胞的凋亡率具有显著性差异（P〈0.01），Ad.egfp组细胞凋亡率无显著性差（P=0.060），提示Ad.mda-7.egfp诱导的细胞凋亡具有明显的肿瘤选择性，为肺腺癌的基因治疗奠定了良好的实验基础。

附图说明

图1为本发明胚胎肾细胞HEK293细胞总RNA。

图2为本发明RT-PCR产物电泳图。

图3为本发明PMD18-T- mda-7/IL-24经BglII及HindIII 双酶切电泳图。

图4为本发明PMD18-T- mda-7/IL-24 测序结果。