[发明专利]建立iPS的方法

权利要求书

1.一种建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法（无血清）培养8天，将episomal的三个质粒：pEV SFFV-OS(OS)，pEV SFFV-MK(MK)，pEV SFFV-B(B)电转到单核细胞中，之后用vitrinectin（人源蛋白）处理的板子上培养，利用E6培养基培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基培养，传代到10后鉴定。

2.根据权利要求1所述建立iPS的方法，其特征在于：所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL-3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml。

其中Serum free medium(SFM)组成为：

3.根据权利要求1或2所述建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步骤：

利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法（无血清）培养8天，利用Amaxa细胞核转染仪(Amaxa Nucleofector^TM)进行细胞核转染，单个核细胞培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配置好的电转缓冲液（包含不同组合质粒如5ug pEV SFFV-OS(OS)+2.5ug pEV SFFV-MK(MK)+2.5ug pEV SFFV-B(B)），混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。将电转后细胞种到预先人源蛋白处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养1天，加等量的hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养1天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液；在调单克隆之前在低氧培养条件下培养，所述的低氧培养条件为5%O₂，5%CO₂，90%N₂；

并在培养基中加入0.25mM NaB提高重编程效率，第10天停止，第12-15天开始可见克隆开始形成，第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统，一周后可用化学方法消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系。