[发明专利]建立iPS的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立iPS细胞的方法，特别涉及一种在无插入的基础上建立了无FBS，无Feeder无动物源的人iPS的方法。 

背景技术

2006年，日本科学家Yamanaka的研究组将4种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）导入小鼠皮肤成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导性多能性干细胞”(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)^[1]。2007年，Yamanaka博士 ^[2]和美国Thomson博士研究组^[3]分别用特定的因子诱导人类成纤维细胞，也使之成为了iPS细胞。iPS细胞的分离培养成功是干细胞研究乃至生命科学领域的里程碑，它首次证明：可以用已知的几种因子在体外逆转已经分化的细胞，使之成为全新的具有发育全能性的细胞，这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题。 

尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而重编程效率低下一直都是科学家们头疼的问题，成为了iPS临床转化的重要障碍之一。经典的利用病毒为载体将转录因子导入分化细胞的方法，很可能导致外源基因插入细胞的基因组中,引起插入突变,存在很大的弊端，iPS细胞的致瘤性影响其在再生医学和临床细胞治疗中的应用^[4]。转录因子c-Myc本身就是一种原癌基因。解析体细胞重编程过程中的分子调控机制，开发出高效安全的iPS技术成为了近年来干细胞领域研究人员的热点。 

供体细胞类型影响iPS细胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究组尝试利用小鼠胃和肝的细胞诱导iPS细胞，发现由胃和肝细胞产生的iPS细胞的成瘤性明显低于皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞^[5]。采集皮肤细胞重编程为iPS细胞需要六七十天时间，而从血液采集细胞制备iPS细胞只需3周左右，而且人外周血细胞来源丰富，采集方法便利，创伤性小，安全性好。人外周血细胞是当前最理想的供体细胞之一，具有安全、方便、数量多等优势^[6]。 

使用病毒载体转染外源基因制备iPS细胞不仅操作过程复杂、对实验室设备和管理要求严格，而且细胞有可能引发肿瘤的形成，这就阻碍了iPS细胞技术的普及和在临床应用的推广。当前应用基因非整合方法建立iPS细胞主要有以下几个方面1）腺病毒载体，2）质粒或者 minicircle DNA，3）蛋白直接导入，但是这三种方法重建效率均非常低，难以满足基础实验需要和临床应用研究。仙台病毒^[7]及改良mRNA方法^[8]建立非整合iPS细胞的效率很高，但是费用相当高，不适用于大规模临床治疗的开展。Episomal Vectors是目前最高效最经济的基因非整合建立iPS细胞的方法^[9]。 

2013年5月张孝兵教授^[10]应用改良的表达Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc的EV成功地将人外周血单个核细胞重编程为iPS细胞，重编程效率显著高于以往实验报导。 

虽然我们利用episomal技术可以获得没有外源基因插入的iPS技术。解决了因为外源基因的插入，诱导基因组不稳定和成瘤性的危险，大大促进了iPS技术临床应用的可能性。但在体外培养细胞Feeder细胞以及处理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS，这些可能会造成免疫和异源病毒或蛋白造成的疾病的产生，增加疾病治疗的风险，而且增加了IPS的使用成本，不适合广泛的、大规模的临床应用，研究在无插入外源基因建立IPS的技术基础上，无添加FBS、Feeder建立IPS的方法，具有重要的临床价值。在发明中，我们在无插入的基础上建立了无FBS，无Feeder无动物源的iPS建立技术。使iPS技术更符合临床应用的需求。 

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006;126:663--76.