[发明专利]黑灵芝真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种FIP-gas蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述的FIP-gas基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，通过同源克隆技术从黑灵芝（Ganoderma atrum）菌丝体中克隆得到，将黑灵芝真菌免疫调节蛋白FIP-gas基因构建成原核表达载体pET-30a-FIP-gas转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后得到；

所述的分离纯化方法，具体包括如下步骤：

1）构建表达载体；

2）转化至大肠杆菌；

3）扩大培养；

4）IPTG诱导表达；

5）分离纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤1）构建表达载体的具体方法为：

1.1）根据黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因FIP-gas的序列，设计引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和HindⅢ，以构建原核表达载体;

1.2）以FIP-gas基因为模板，经PCR扩增后，将FIP-gas基因克隆至中间载体;

1.3）用双酶切将FIP-gas片断从中间载体上切下，回收相应片段，用T4连接酶16℃连接过夜得表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤1.2中的所述的中间体为pMD18-T simple vector或pET-30a。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤2）的具体方法为：将所述的表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42℃循环水浴热击90s，迅速冰浴2min；加入800μL LB培养液37℃慢摇复苏1h；取200μL菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，筛选转化子并挑取阳性克隆。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤3）的具体方法为：将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37℃继续发酵。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤4）的具体方法为：当发酵液OD₆₀₀达到0.5～0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤5）的具体方法为：

5.1）将经过IPTG诱导的菌液离心收集细胞，悬浮于缓冲液中；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化；

5.2）将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎；

5.3）超声处理过的菌液离心取上清，上Ni-NTA柱，用缓冲液1洗柱后，用缓冲液2将目的蛋白洗脱出来。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的缓冲液1为50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，20mM imidazole，pH为8.0的水溶液；所述的缓冲液2为50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，250mM imidazole，pH8.0的水溶液。

9.一种根据上述任一权利要求所述方法制备得到的FIP-gas蛋白的应用，其特征在于，将其用于制备抗肿瘤药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是指：人乳腺癌细胞MDA-MB-231。