[发明专利]黑灵芝真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学、基因工程技术领域的方法，具体是一种黑灵芝真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory proteins，FIPs)是从灵芝中分离得到的继多糖和三萜类化合物后，又一类活性物质。在FIPs家族中，目前已经报道有7种蛋白，分别为命名为LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja(AY987805)、FIP-gmi和FIP-gsi，分别来源于赤灵芝(Ganodermalucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulinavelutipes)、草菇(Volvarielavolvacea)、紫灵芝(G.japoncium)、小孢灵芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis)[Li QZ，Wang XF，Zhou XW.Recent status and prospects of the fungal immunomodulatory protein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011,31(4):365-375]。该蛋白家族中，直接从天然蕈菌中分离得到的真菌免疫调节蛋白仅有四种，它们分别是：LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫调节蛋白则是通过基因重组技术表达而来，其氨基酸序列是由基因序列翻译后得到的。Wang XF等经过比对发现，FIPs的氨基酸序列同源性较高，一般可达60-70%左右[Wang XF,Su KQ,Bao TW,et,al.Immunomodulation effects of fungal proteins.Current Topics in Nutraceutical Research.2012,10(1):1-11.]。

FIPs具有一定的免疫调节功能，在抗过敏、抗肿瘤、促进淋巴细胞的增殖、诱导细胞分泌细胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗肿瘤作用尤其引起大家兴趣。Lin JW等经MTT（四唑盐）实验和流式细胞仪检测，在毕赤酵母中表达的FIP-glu可以通过诱导细胞凋亡抑制人类白血病NB4的表达水平(32μg/mL FIP-glu可诱导约35%的人类白血病NB4细胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin JW,Hao LX,Xu GX,et al.Molecular cloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatory protein from Ganodermalucidum in Pichiapastoris.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,25(3):383-390]。Liao CH等在大肠杆菌中表达的FIP-gts在人类肺腺癌A549细胞中表现出抗肿瘤活性。当FIP-gts的浓度达到4-10μg/mL时，可有效控制癌细胞的转移，具有很好的抗肿瘤效果[Liao CH,Hsiao YM,Lin CH.Induction of premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory protein from Ganodermatsugae.Food and Chemical Toxicology,2008,46(5):1851-1859]。Liao等（2006）研究认为，FIP-gts虽能显著抑制人类肺腺癌A549癌细胞的生长，但是不会影响正常MRC-5纤维原细胞的生长，它在mRNA水平下调端粒酶催化亚基的表达，抑制端粒酶的活性并具有剂量依赖效应。端粒酶在正常的体细胞里一般不被活化，它的活性有无往往会成为决定细胞无限增殖的关键因素。同时，FIP-gts可以促进NK细胞（natural killer cell）、巨噬细胞以及活化血清抗体的生成，有效地调节免疫功能，一定程度上也可以抑制癌细胞的生长[Liao CH,Hsiao YM,Hsu CP,et al.Transcriptionally mediated inhibition of telomerase of fungal immunomodulatory protein from Ganodermatsugae in A549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis,2006,45(4):220-229]。