[发明专利]贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法

说明书

技术领域

本发明属于电化学检测技术领域，具体地涉及一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法。

背景技术

大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）属多环聚醚类脂溶性贝类毒素，是海洋腹泻性贝类毒素的主要成分。OA可通过食物链富集于贝类等滤食性海洋生物体内，导致消费者胃肠功能紊乱，出现腹泻、呕吐和腹痛等中毒症状。研究证实，OA及其衍生物鳍藻毒素能够抑制蛋白磷酸酶的活性，是一类潜在的肿瘤促进因子，且呈现出发生频率增加、分布区域扩大、危害日益严重的发展趋势，已成为国际社会共同关注的重大食品和生态安全问题，也是发达国家制定监控计划和贸易壁垒的主要目标。欧盟、德国和英国等多个国家规定双壳贝类可食性组织中腹泻性贝类毒素不大于160μg/kg(以OA计)，不过近期欧盟对OA的毒性进行了重新评估，认为现行限量标准不足以保护消费者安全，拟将该限量标准降低到45μg/kg。

目前，检测大田软海绵酸的方法有小鼠生物法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析法等。小鼠生物法的毒素提取过程繁琐，需时较长（通常需24h），且易出现假阳性，检出限偏高，重现性较差，而液相色谱和液相色谱-串联质谱法需要价格昂贵的仪器和专业的人员操作，过程复杂，不能实现快速和现场检测。电化学检测法具有灵敏度高、操作简便、快速、经济、环保等优点，尤其是电化学免疫传感器分析技术因干扰少，检出限低，样品预处理及仪器设备简单而易实现现场检测，可提供实时快速、简单便携和低成本的分析方法，但在贝类毒素的检测上应用较少，具有自主知识产权的贝类毒素电化学检测技术有待突破。

硫堇属于吩噻嗪类，具有优良的电化学活性，聚硫堇相对于单体而言有强大的附着力，不易流失，比表面积大，反应活性高，催化效果好；亚甲基蓝作为一种生物染料也是一种比较活泼的电子转移体，在导电基质上具有良好电化学行为，其导电聚合膜具有良好的电化学活性和电催化性能。目前，聚硫堇和聚亚甲基蓝作为高性能的电子交换聚合物已被广泛用作直接电化学电极的功能基质膜和电子媒介体，但鲜有聚硫堇-亚甲基蓝复合电聚合膜用于非标记型电化学免疫传感器的构建。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，以克服现有检测贝类毒素大田软海绵酸技术上的不足，如仪器复杂、昂贵、步骤繁琐等缺点。本发明在金电极表面通过循环伏安法电聚合一层聚硫堇-亚甲基蓝复合膜，并借助纳米金的导电性、生物相容性与高比表面的特性实现抗体的有效固定，利用具有特殊分子结构的OA与其抗体特异性结合生成以阴离子形式存在的免疫产物，能阻碍电极表面电子传递的特性，构建了一种非标记型电化学免疫传感器，结合电化学工作站，实现了对贝类中大田软海绵酸的电化学检测。

本发明是通过以下技术方案实现的:

一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，包括以下步骤:

（1）金电极的预处理：金电极打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡，在稀H₂SO₄溶液中于-1.0～1.55V电位下循环扫描，取出后用水冲洗，吹干；

（2）传感器的制备：将步骤（2）处理后的金电极置于含有终浓度为1mmol/L硫堇、4mmol/L亚甲基蓝、0.1mol/L氯化钾和pH6.010mmol/L PBS缓冲液的混合溶液中，于+1.5V恒电位下静置，然后用循环伏安法扫描，形成硫堇-亚甲基蓝复合聚合膜；用水充分淋洗金电极后，将其浸于纳米金溶液中，以在金电极上获得纳米金层；取大田软海绵酸单克隆抗体涂覆在金电极表面，室温下反应；滴加牛血清白蛋白（BSA）溶液以覆盖多余的非特异性位点，即完成传感器的制备；

（3）大田软海绵酸的测定：将不同浓度梯度的OA标准溶液或样品溶液滴加到步骤（2）所制备的传感器表面，反应后，使用电化学工作站进行差示脉冲伏安测量，记录免疫反应前后峰电流值。

进一步，步骤（2）所述的纳米金溶液的合成方法为：取HAuCl₄溶液加热煮沸，在搅拌回流状态下迅速加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，待溶液颜色变为深酒红时，即完成纳米金的合成，其中HAuCl₄与柠檬酸三钠的质量比为1：3。

进一步，所述的HAuCl₄溶液和柠檬酸三钠的浓度分别为0.01%（重量比）、1%（重量比）。

进一步，步骤（3）所述的样品溶液的获取方法：称取贝样，加入甲醇水溶液均质提取，离心后定容；取提取液用氮气吹干，用PBS缓冲溶液定容，超声波震使荡残留物充分溶解，溶解液过滤膜后待测。