[发明专利]一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒

权利要求书

1.一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内有序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条引物核苷酸和pMD19- Agouti标准质粒载体SEQ ID NO：3核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还放置有SYBR^? Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²⁺，Tli RNaseH，SYBR^? Green I）和ROX Reference Dye II。

3.  根据权利要求1和2 所述的试剂盒的使用方法，其特征是：PCR最佳反应体系为18 μL，其中包含SYBR Premix Ex Taq(2×) 9 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2引物（10μM/μL）各0.8 μL，ddH₂O 6 μL，模板DNA 1 μL，PCR条件: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃复性延伸30 s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65 ℃升温至95 ℃，根据溶解曲线判断产物特异性和循环阈值Ct。

4.权利要求1或2所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒的使用方法，其特征在于首先将权利要求1中已知浓度的pMD19- Agouti标准质粒倍比稀释6个梯度，选取其中5个浓度梯度作为计算Ct值标准曲线的线性回归方程的荧光定量PCR扩增反应的模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和权利要求2中所述的SYBR^? Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²⁺，Tli RNaseH，SYBR^? Green I）和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR 扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性，根据不同浓度标准质粒的Ct值计算Ct值标准曲线的线性回归方程；再以待检羊只的DNA为荧光定量PCR模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和权利要求2中所述的SYBR^? Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²⁺，Tli RNaseH，SYBR^? Green I）和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR 扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性,将获得的待测样品的Ct值代入权利要求4所得的Ct值标准曲线的线性回归方程计算待测样品拷贝数。