[发明专利]定量检测人表皮生长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒及检测方法

权利要求书

1.定量检测人表皮生长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括HER-2试剂卡、HER-2缓冲液和HER-2标准卡；

所述的HER-2试剂卡为一种用于干式免疫层析试验的膜载体，HER-2试剂卡包括带有粘合剂的衬板，衬板上设有相互搭接的样品垫、抗体承载膜和吸水垫，其中，所述的抗体承载膜为硝酸纤维素膜；所述的抗体承载膜上涂有线状或带状的作为质控线的兔抗小鼠2抗和线状或带状的作为检测线的小鼠抗人HER-2的单克隆抗体；所述的HER-2缓冲液含有抗HER-2单克隆抗体与三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素；所述的HER-2标准卡中存储有HER-2标准曲线。

2.按照权利要求1所述的定量检测人表皮尘长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒，其特征在于：所述的HER-2试剂卡采用如下步骤制成：

1、称取7g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、1g NaN₃和6g甲基纤维素于容器中，称取4g吐温20(TWEEN-20)，加适量水使吐温20(TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节容器中溶液的pH，控制pH在7.95-8.05之间；

4、称取牛血清白蛋白(BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素1g，全部倒入上述容器中，充分混匀；

5、用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得到免疫缓冲液，备用；

6、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中，备用；取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol／L PB缓冲液中至总体积为1ml，获得一级抗体溶液，用移液枪吸取备用的溶于50ul二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述一级抗体溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；

7、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中，在3000g下离心30min，浓缩至0.5ml，获得三级抗体溶液；

8、取0.5ml荧光颗粒，加入5ml反应杯中，经静置沉淀2分钟后，吸取上清，然后向反应杯中加入1.5ml PH9.50.1mol／L PB，混匀30秒，然后向反应杯中加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的荧光颗粒的保存液；

9、向步骤8所述的反应杯中加入0.3ml 1mol／L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后向反应杯中加入1.5ml PH7.20.1mol／L PB清洗已经标记的荧光颗粒的保存液，混匀30秒；

10、用10ml PH7.20.1mol／L PB将步骤9获得的已经标记的荧光颗粒转入玻璃瓶；

11、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的荧光颗粒的保存液中，再将该已经标记的荧光颗粒的保存液加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再向玻璃瓶中加入5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的免疫荧光颗粒，并混匀30秒；

12、用50ml荧光颗粒保存液将免疫荧光颗粒转入玻璃瓶，配制得免疫荧光颗粒浓度为0.05％的标准浓度荧光颗粒使用液；

13、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫缓冲液按照1：1的体积比例混匀，即得HER-2荧光颗粒试剂(其使用浓度为0.025％)；

14、将步骤7所得的三级抗体溶液与步骤13所得的HER-2荧光颗粒试剂分别以线状或带状连接抗体承载膜上形成质控线与检测线。并在带有粘合剂的衬板上相互搭接地粘合样品垫、抗体承载膜、吸水膜，即得所述的HER-2试剂卡；

所述HER-2缓冲液采用如下步骤制成：

1、取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl₂0.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl₂0.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解；

2、加入盐酸或氢氧化钠溶液调烧瓶中溶液pH，控制pH在7.35-7.45范围内；

3、称取牛血清白蛋白(BSA)3g倒入上述烧杯中；

4、用纯化水定容至1000ml，用0.2μμm滤器过滤，得试剂1稀释液，备用；

5、取10mg抗HER-2单克隆抗体，加入5ml尘理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升，获得浓缩液；

6、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；

7、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1ml的4mg／ml NaBH₄溶液，混匀，置4℃下2小时；

8、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；

9、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15MpH7.4的PBS中，获得溶液；

10、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB缓冲液透析5个小时，去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1体积的上清液：100体积的MgCl₂的比例，添加1M MgCl₂溶液，即得抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的抗HER-2单克隆抗体的偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的抗HER-2单克隆抗体的偶联物：1000体积的试剂1稀释液的体积比混合均匀，即得HER-2缓冲液；

所述的HER-2标准卡采用如下步骤制成：

1、将HER-2抗原浓度分别为0、15、45、90、80、350ng／ml的标准液分别加入6支HER-2缓冲液中混匀后，然后将混合后溶液取100ul滴入HER-2试剂卡上的样品垫上，等待15分钟后，使用干式荧光免疫分析仪进行检测，将检测得到的荧光值为坐标轴Y轴，上述之标准液浓度为X轴进行四参数拟合，然后将拟合计算得到的4个参数记录到标准卡内，既得HER-2标准卡。

3.如权利要求1或2所述的定量检测人表皮尘长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)、将待检测标本取10ul加入到HER-2缓冲液中，然后轻微混匀，不要产生气泡；

2)、在混合后的HER-2缓冲液中取出100ul加入到HER-2试剂卡的样品垫上；

3)、15分钟后，将HER-2试剂卡与HER-2标准卡分别插入干式荧光免疫分析仪中进行检测，依据所检测到的荧光值与所述HER-2标准卡中的四个参数进行拟合计算，即可得到待检测标本的HER-2浓度。