[发明专利]一种间充质干细胞的定向分化诱导方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞的定向分化诱导方法，利用微纳多级结构二氧化钛纳米管调控间充质干细胞定向分化为类平滑肌细胞，利用紫外光刻蚀技术融合阳极氧化技术制备二氧化钛纳米管微沟槽结构，并结合频繁传代换液的培养方法，在未加入生化诱导因子的前提下，在所述微沟槽结构上直接诱导干细胞分化，并最终获得类平滑肌细胞，包含如下步骤：

1）带有TiO₂纳米管结构的微沟槽制备

使用紫外光刻蚀技术融合阳极氧化技术在医用植入金属钛表面同时制备有序可控的微图形和纳米管结构——微纳多级结构表面，所述微图形为长条形沟/脊交错分布结构，沟/脊宽度分别为5-25μm/5-25μm，纳米管管径为30-100nm，管0厚度约10-50nm，管长为300-500nm，沟槽落差为300-500nm；

2）频繁传代换液定向诱导分化MSCs

将MSCs直接培养于1)所得微纳多级结构表面，在不加入任何生化诱导因子的前提下，依靠TiO₂微纳多级结构本身进行细胞换液培养，最终获得类平滑肌细胞，制备步骤为：将原代提取的MSCs细胞以0.5×10⁴-2×10⁴个/ml的密度直接垂悬种植到有微纳多级结构的二氧化钛纳米管的容器内；MSCs培养基为无任何生化诱导因子添加的85%的DMEM基础培养基+15%的胎牛血清；每隔两天换液一次，细胞铺满样品表面后需进行再传代，如此反复4-8周，经过10-20次频繁传代换液培养,收集样品表面细胞得到目标产物类平滑肌细胞。

2.根据权利要求1所述之间充质干细胞的定向分化诱导方法，其特征在于，所述微纳多级结构表面的制备包括如下步骤：

A.光刻图形的制备流程:

a)将钛基底制备成大小合适的尺寸并将表面打磨抛光，清洗干燥后备用;

b)取出洗净并干燥处理后的钛基底，使用匀胶机把正性光刻胶均匀涂覆在钛基底表面，放入烘箱90-120℃，坚膜10m-30min;

c)光刻机上添加掩模板进行紫外曝光操作，光强为16毫瓦/cm²,曝光10秒，λ=365nm;

d)然后马上进行显影被紫外光照射到的区域，光刻胶溶解，掩膜板遮住的区域则留在样品表面，显影后清洗曝光后的钛基底，就得到有光刻胶图形的钛基底；

e)再放入烘箱90-120℃后烘10-30min备下一步使用；

B.通过二次阳极氧化制备二氧化钛纳米管微图形的流程：

a)配置电解液，使用溶质为氟化铵，添加剂为氯化钠和丙三醇，其余溶剂为双蒸水；

b)连接阳极氧化装置，将A步骤中得到的涂敷光刻胶的钛基底作为阳级，石墨片作为阴极，进行电化学阳级氧化处理，即可在钛基底表面生成一种管径均匀一致二氧化钛纳米管的薄膜；

c)将一次阳极氧化处理后的钛基底浸入丙酮溶液中洗除钛基底表面的光刻胶；

d)并将样品浸没在丙三醇溶液内超声处理，将B-b)步骤中一次阳极氧化得到的二氧化钛纳米管全部超声震荡打断，并清除掉；

e)进行二次氧化，方法同步骤B-b)；

f)得到的微纳结构的二氧化钛纳米管依次用无水乙醇、去离子水各清洗至少三遍，并进行烘干60℃处理；

g)将f)处理后得到的样品进行500±50℃，3±1小时热处理后再清洗，并烘干保存。

3.根据权利要求1所述之类平滑肌细胞的获得方法，其特征在于，MSCs细胞获得采用原代提取MSCs采取梯度密度法进行。

4.根据权利要求1所述之类平滑肌细胞的获得方法，其特征在于，细胞换液培养时，换液消化使用0.25mg/ml的胰酶，培养条件为37℃，5%CO₂的湿润环境。

5.根据权利要求1或2所述之间充质干细胞的定向分化诱导方法，其特征在于，进行频繁传代换液的培养方法时，样品的灭菌处理采用UV灭菌法，MSCs原代培养后直接接种在样品表面；传代所用之容器和二氧化钛纳米管微沟槽样品时需要使用未培养过干细胞的二氧化钛纳米管微沟槽结构表面，以保证材料表面对前代细胞有一个持续不断的诱导的影响作用；传代时细胞的种植密度保持不变。