[发明专利]一种间充质干细胞的定向分化诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用光刻图形技术结合阳极氧化生成纳米管，制备出一种微纳多级结构的纳米管图型化材料界面，并且利用一种频繁传代换液的方法在这种材料界面上诱导干细胞定向分化的技术，属于生物材料表面工程与组织工程交叉领域。

背景技术

光刻蚀技术在电子、化工等领域有着非常广泛的应用，在组织工程学特别是生物医学工程领域也发挥着很重要的作用，这是因为微米/纳米级别的材料表面拓扑结构对细胞的粘附、增殖、分化、凋亡都起到一定的影响。多尺度微纳复合结构在生物界面中发挥着重要的、有时甚至是决定性的作用。原位活体成像技术揭示了真实血管的内表面就是一种非常典型的多尺度微纳复合结构：沿血流方向的亚微米尺度沟槽以及沟槽表面纳米级的包状突起。提示了具有纳米结构的微沟槽可以非常良好的控制细胞的生长取向，起到模拟人体内组织天然的排列方式，是仿生化重要参考依据。本发明将参考光刻蚀技术制备出一种全新的二氧化钛(TiO₂)纳米管微沟槽的表面结构形式，并利用这种材料界面定向诱导间充质干细胞(MSCs)分化为类平滑肌。

钛及其合金在生物医学植入材料上有着非常广泛的应用，包括，骨及骨关节的置换装置，牙科材料，人工血管支架，人工心瓣以及颌面和颅面支撑植入性材料等等。但钛作为一种惰性材料，在植入人体后的细胞相容性需要进一步改善，而TiO₂纳米管具有独特的结构和优异的性质，如高表面能、大比表面积、超亲水性质等，因此被广泛的应用于诸如生物传感器、太阳能电池、光催化、光电解以及生物医用材料等等上面。相当大的研究结果表明，TiO₂纳米结构的表面可以积极有效的促进细胞行为改变，比如促进材料表面的钙磷化加速形成，增强骨细胞的粘附，增殖以及分化等。而将TiO₂纳米管作为植入性医疗器械进行研究的过程中，已经有了很多细胞学评价，在研究TiO₂纳米管装载BMP-2细胞诱导因子后定向诱导干细胞分化为成骨细胞上已经有了一些研究成果。但是，将具备TiO₂纳米结构的微沟槽应用生物材料领域的研究尚未见报道；将具备TiO₂纳米结构的微沟槽应用于干细胞定向分化的研究也尚未见报道。

当前制备TiO₂纳米管的方法主要有以下几种，辅助模板法，电化学阳极氧化法，以及水热合成法等等。其中电化学阳极氧化的方法因为制备的纳米管排列方式上高度有序，且一致性极高，从而被广泛的应用。这种方法制备的纳米管规格尺寸，如管径，管高受到不同电解液、应用电压、PH值高低以及阳极氧化时间的长短来控制。经过阳极氧化生成的二氧化钛纳米管是非晶态，也叫无定形态的TiO₂纳米管，而经过热处理之后TiO₂纳米管形成金红石和锐钛矿的混合晶相。TiO₂纳米管制备工艺已基本成熟。一次氧化图案的制备工艺已有报道研究。但是，结合光刻技术和二次阳极氧化技术制备二氧化钛多尺度微纳复合结构——直接让纳米管呈微沟槽分布的工艺尚未见报道。

干细胞自被发现以来，因其潜在的多分化潜行和良好的增殖能力成为组织工程学种子细胞的不二之选，而间充质干细胞（MSCs）作为一种来源广泛，取材方便的干细胞也成为种子细胞研究的热点。在研究材料诱导间充质干细胞（MSCs）定向分化的工作中，传统采用的方法是对直接种植在材料表面的干细胞进行长时间培养，在培养过程中不进行换代操作，并需要加入生化诱导因子，而本研究采用的是一种频繁传代换液的培养模式，在细胞铺满样品表面后即刻进行消化，垂悬再次接种到全新的材料表面，如此反复10-20代培养，直至鉴定到干细胞分化为类平滑肌细胞为止，时间大概持续4-8周左右。这种在不加入任何生化诱导因子的条件下，仅凭频繁换代的方法强化沟槽结构二氧化钛纳米管的诱导作用的研究尚未见报道。

发明内容

鉴于目前在研究TiO₂纳米管定向诱导干细胞的过程中一般需要生化诱导因子的加入，且培养方式均为不传代式短期或长期培养，没有真正参考材料对干细胞诱导的直接诱导因素。本发明的主要目的是提供一种间充质干细胞的定向分化诱导的新方法，利用紫外光刻蚀技术融合阳极氧化技术制备出一种TiO₂纳米管微沟槽结构，并结合频繁传代换液的培养，在未加入生化诱导因子的前提下，纳米管微沟槽结构直接诱导干细胞分化，并最终获得类平滑肌细胞。

本发明主要通过以下技术路线加以实现。