[发明专利]细胞DNA损伤检测方法

权利要求书

1.细胞DNA损伤检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）凝胶板的制备：将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；

2）细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；

3）DNA碱解旋：用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；

4）电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液的电泳槽中进行电泳；

5）中和：将电泳后的胶板在Milli-Q水中浸泡；

6）脱水与晾干：用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存；

7）染色以及图像采集：在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Milli-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。

2.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法为：将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热；所述预热的温度可为37℃。

3.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤1）中，所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中是取50～80μL混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开可采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件可为4℃下冷却3～5min；所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为0.4%～0.6%，所述待测样品细胞密度为8～10×10⁵个/mL，细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1∶3～5。

4.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤2）中，所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解是将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4℃的细胞裂解液中避光裂解1.5～2h。

5.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤2）中，所述细胞裂解液的组成为100mmol/L Na₂EDTA、2.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH=10；临用前加Triton X-100至体积分数1%，同时加DMSO至体积分数10%。

6.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤3）中，所述静置是在4℃避光静置15～25min；所述解旋液的组成可为1mmol/L Na₂EDTA，300mmol/L NaOH，pH>13。

7.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤4）中，所述电泳液为TAE，50×TAE配制方法为242g Tris-base、37.2g Na₂EDTA·2H₂O，加入57.1mL的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3，Milli-Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4℃冷藏2h以上；所述电泳的条件可为：电泳的电压为15～25V，恒压，电泳的时间为10～30min。

8.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤5）中，所述浸泡是浸泡5～10min，重复2～3次。

9.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤6）中，所述静置浸泡的时间为10～15min。

10.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤7）中，所述静置的时间为2～3min；所述溴化乙啶的浓度可为1μg/mL，所述避光染色的时间可为10～15min。