[发明专利]细胞DNA损伤检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞损伤检测，特别是涉及一种细胞DNA损伤检测方法。

背景技术

在癌症病人中，DNA遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏，这表明癌症的发生与DNA损伤具有十分密切的关系。目前环境中存在着多种多样有害物理、化学因子（如紫外辐射、农药残留以及其他有机污染物等）能直接或者间接引起细胞DNA损伤，而且每年还有大量的新增因子进入环境中，那么快速有效地对现有以及新进入环境因子进行致DNA损伤毒性检测，有利于及时采取措施对有害因子进行控制和治理，减少相关癌症以及遗传性疾病的发生，对于环境监测和保护具有重要意义。

单细胞凝胶电泳技术(Single cell gel electrophoresis，SCGE)作为检测细胞DNA损伤的方法之一，由Ostling等人首次提出，经Singh等人进一步改善后建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。其制胶板过程：将正常熔点琼脂糖(NMA)滴到载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，冷凝；将含样品细胞的低熔点琼脂糖(LMA)滴到第一层胶板上，使其凝固；最后在再滴加LMA。第一层的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。随后进行裂解、解旋、电泳、染色、结果观察。其制胶板过程工艺复杂，每次样品检测数量有限，而且在后期操作中容易脱胶，导致实验失败。

近几年，研究者对常规单细胞凝胶技术不断进行改进。

Peggy等人（Peggy L O,Judit P B.The commet assay:a method to measure DNA damage in individual cells.Nature Protocols.2006,1:23-29）将载玻片用1%正常熔点琼脂糖凝胶浸泡，取出擦净一面后烘干得一面附有底膜的玻片，保存备用。随后可将与待测细胞样品混匀的琼脂糖凝胶铺于预先镀膜的胶板上。

McNamee等人（McNamee J P,McLean J R,Ferrarotto C L,Bellier P V.Comet assay:rapid processing of multiple samples.Mutation Research.2000,466:63-69）在常规SCGE的基础上提出了Gelbond法，使用一种能够粘附低熔点琼脂糖凝胶的膜代替常规SCGE中的底膜，其它步骤不变，该方法相对常规SCGE能够有效减少掉胶率，但是具有粘附低熔点琼脂糖凝胶功能的Gelbond膜价格昂贵，而且不能重复利用，大量使用时成本较高。

David等人（David K W,David M W,Sangeeta N B.Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.PNAS.2010,107:10008-10013）在使用Gelbond膜的基础上，引入微室阵列法。该方法为先采用SU-8型感光树脂、平板印刷版、硅晶圆等材料经过UV射线照射，丙二醇甲醚醋酸酯显影等步骤制得微室模具，再在铺有溶解的正常熔点的琼脂糖凝胶的Gelbond膜上用模具制微室，待胶凝固后，移去模具，制得微室，微室制好后，即可在微室中加入待测细胞样品，并铺上一层低熔点琼脂糖凝胶，凝固后按常规SCGE进行后面的步骤。微室阵列法较常规SCGE改进了胶板的制备过程，并且微室中的每一个细胞位置明确，采用全自动分析，确保分析到每一个细胞，但是微室阵列法中微室模具制作过程精密复杂，模具需随着细胞大小的变化而变化，改变受试细胞时，需重新优化模具，过程复杂，全自动阅片需要有专门的配套设备，硬件和技术要求高，影响其推广和应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种快速、灵敏度高、工艺简单的细胞DNA损伤检测方法。

本发明包括以下步骤：

1）凝胶板的制备：将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；

2）细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；

3）DNA碱解旋：用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；

4）电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液（TAE）的电泳槽中进行电泳；

5）中和：将电泳后的胶板在Milli-Q水中浸泡；