[发明专利]硝基呋喃类药物代谢物的衍生物及高效液相色谱荧光检测

权利要求书

1.一种硝基呋喃类药物代谢物的衍生物，其特征在于：它包括下列用量的组合物：

甲醇钠 0.1128g    甲  醇 0.23ml 乙醇肼 1.35ml

碳酸二甲酯 2.53ml 2-羟基-1-萘甲醛 0.344g 乙  醇 25ml。

2.一种硝基呋喃类药物代谢物的衍生物的制备方法，其特征在于：它包括下列步骤：

（1）称取甲醇钠0.1128g，量取甲醇0.23ml，乙醇肼1.35ml，加入50ml三口烧瓶中，充分搅拌20min，使甲醇钠充分溶解，烧瓶内为无色透明溶液；

（2）加入碳酸二甲酯2.53ml，70℃保温1h，缓慢搅拌升温至75℃，敞口回流蒸出甲醇，回流2h至甲醇蒸馏完毕，结束反应，得到AOZ的合成液；

（3）称量0.344g  20mmoL  2-羟基-1-萘甲醛，用25mL乙醇溶解，将此溶液滴加到AOZ合成液中，滴加时要注意速度，约3s一滴，边搅拌边滴加，滤液逐渐变浑浊，溶液为淡黄色，70℃回流2小时，三口烧瓶内上层为淡黄色液体，下层为白色沉淀，趁热过滤后，将淡黄色滤液结晶得到淡黄色晶体，水洗3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，最后用无水乙醇重结晶，干燥称重，即得代谢物，质量为0.2815g；

¹HNMR（400MHz，d₆-DMSO）δ:12.08(s，1H)，8.67(s，1H))，8.58(d，J=4.4Hz，1H)，7.89(q，J=5.7Hz，2H)，7.55-7.59(m，1H)，7.40(t，J=4.3Hz，1H)，.22(d，J=4.5Hz，1H)，4.59(t，J=4.3Hz，2H)，4.14(t，J=4.2Hz，2H)；ESI-MSm/z257.38[M+H]⁺；元素分析实测值C₁₅H₁₂N₂O₃：C，65.72;H，4.69;N，10.94.理论值：C，65.62;H，4.72;N，10.93;O，18.73。

3.一种高效液相色谱荧光检测的方法，其特征在于：它包括下列步骤：

（1）配制溶液

称取动物源性和水产品样品5.00g，加入10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液7+3，体积比，充分水解，再加入200μL2-羟基-1-萘甲醛甲醇溶液25mmol/L于50℃水浴衍生2h，用乙酸乙酯萃取，萃取液在40℃下用N₂吹干后，用1mL的乙腈水溶液乙腈∶水=8∶2/v:v重新溶解，该溶液采用高效液相色谱荧光仪测定，外标法定量；

（2）试样制备

从原始样品取出有代表性样品500g，用捣碎机捣碎混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，将试样置于-18℃冷冻避光保存，在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化；

（3）样品处理

①水解和衍生化

称取5.00g试样精确至0.0lg于50mL塑料离心管中，加入10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液7+3，体积比充分搅拌后，超声40min使其充分水解，加入0.20g氯化钾，充分搅拌后，再超声30min，然后以7200r/min离心40min，倾倒上清液于10mL玻璃试管中，再加入200μL2-羟基-1-萘甲醛的甲醇溶液25mmol/L，振荡摇匀后超声10min，置50℃恒温水浴锅中反应2h；

②提取和净化

将衍生化后的溶液，冷却至室温，在60℃下用氮气吹至1mL，加入4mL纯净水，再加入5mL乙酸乙酯，振荡提取5min后，以1000r/min离心5min，收集乙酸乙酯层，残留物用5mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层，收集液在40℃下用N₂吹干，将浓缩物用1mL的乙腈水溶液乙腈∶水=8∶2/v:v重新溶解，用0.45μm有机滤膜过滤后，转移入进样瓶待进样；

（4）测定

液相色谱条件：

色谱柱：YMC-Pack PolymerC₁₈，250×4.6mml.D.S-6μm；

柱温：40℃；

流速:0.7mL/min；

进样量：20μL；

荧光检测条件：灵敏度(EUFS):500；增益(Gain):10；通道1:激发波长(Ex):395nm发射波长(Em):463nm；通道2：激发波长(Ex):260nm发射波长(Em):463nm；

（5）工作曲线

移取AOZ标准溶液，添加到10mL甲醇-0.45mol/L盐酸混合溶液7+3，体积比中，使其浓度分别为0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线，或采用与待测物相近浓度的标样进行单点测定；

（6）加标回收率实验

以阴性控制样品为测试样品，按照实验方法进行提取、净化和测定，在1.0、5.0和10.0μg/kg3个浓度水平上进行加标回收试验，对应工作曲线法计算每个样品的浓度，并计算回收率。