[发明专利]检测禽流感病毒H7N9亚型的RT-LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体的说涉及一种检测禽流感病毒H7N9亚型的逆转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）特异性引物组合及检测试剂盒。

背景技术

过去国际上曾经发生过H7亚型禽流感病毒如H7N2、H7N3和H7N7，首例为1959年于美国发生（H7N7）；在2003年2月至6月期间荷兰出现首例H7感染致死病例，过去H7禽流感大多数是在禽类之间传播，没有在人类之间传染，症状一般也比较弱。最早H7N9病毒记录在1988年，来自美国国家生物技术信息中心，感染动物火鸡。2013年3月下旬，人类感染甲型流感H7N9病毒与病例在上海开始并陆续在中国长江三角洲一带的城市被发现，这是该病毒全球首次感染人类。据统计，该次H7N9病毒出现前，全球共检出25株H7N9亚型流感病毒，均来自野鸟，且从未在家禽中发现。中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室研究人员表示，经病毒片段的重配研究，是次H7N9的8个基因片段中，H7片段源于浙江鸭群中分离的禽流感病毒；N9片段与韩国野鸟中分离的禽流感病毒同源，其余6个基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）源于H9N2。

人感染H7N9禽流感病例发生以来，全国各级兽医部门按照农业部动物H7N9禽流感紧急监测和流行病学调查方案要求，积极开展监测工作，目前监测采样和实验室检测工作已基本完成。截至5月22日，全国各级兽医实验室共检测完成899758份样品，其中，血清学样品702369份，病原学样品197389份。样品覆盖全国31个省份和新疆生产建设兵团的42250个监测采样场点。

2013年5月22日前国家食品药品监督管理局发文公告批准了上海之江生物可用于临床H7N9禽流感病毒检测的试剂盒--H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)。但市场定价较高，如果用于活禽市场或养禽场H7N9的筛查，荧光探针试剂盒成本显得过高，不利于活禽市场筛查工作的开展，无法满足基层和现场检测的需求。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的检测试剂盒能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型流感病毒显得非常迫切。

环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isotherm amplification,LAMP）是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下(60～65℃)保温30～60分钟,即可完成核酸扩增反应。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人（2004）根据LAMP的原理设计了实时定量LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（2007）建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的LAMP检测体系。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性RT-LAMP引物组。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作简单的检测禽流感病毒H7N9亚型的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明提供了用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物组合，包括以下6对引物：检测HA基因的1对外引物、1对内引物和1对环引物，检测NA基因的1对外引物、1对内引物和1对环引物，其核苷酸序列分别为：

本发明提供了上述引物组在制备禽流感病毒H7N9亚型的检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种含有上述6对特异性引物组合的检测试剂。

本发明提供了一种含有上述6对特异性引物组合的禽流感病毒H7N9亚型RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的试剂盒还包含逆转录酶；DNA聚合酶；RT-LAMP反应液；阳性对照和阴性对照；所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄水溶液，三者的体积比是8：5：2。