[发明专利]一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于烟草疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间烟草疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的烟草黑胫病是一种毁灭性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亚的爪哇首次发现，此后该病流行蔓延迅速，1922年便成为美国的佛罗里达、堪萨斯州烟区的严重病害。1924年后，该病己遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田。中国于1950年首次报道，当时该病发生在黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，其中安徽、山东、河南为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍，平均发病率为5％-12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。烟草疫霉的寄主范围很广，可以侵害数百种植物，病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，可多次再侵染，传播与蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年来，由于我国连作烟田面积不断扩大，连作年限不断增加，加重了该病害的流行，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。该病属于维管束系统性病害，一旦发生就很难控制，对烟草威胁极大，并常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重危害。因此建立烟草疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

传统烟草疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。因此，建立一套快速、灵敏、准确的烟草疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，烟草疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中烟草疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种烟草疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的烟草疫霉菌的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1．LAMP引物的设计

我们从GenBank中下载烟草疫霉Ypt（登录号：JN678924.1）基因序列，根据烟草疫霉Ypt基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT；

B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG ；

FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG ；