[发明专利]沼水蛙抗菌肽及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及沼水蛙抗菌肽及其制备与应用，属于生物医学领域。

背景技术

由于抗生素的滥用，许多微生物对抗生素产生了耐药性，出现了许多能够抵抗常用抗生素的超级细菌。寻找抑菌机理不同的抗菌药物成了医疗领域的当务之急。

两栖动物抗菌肽是生物抗菌肽研究中的一个重要组成部分，其特殊的结构和广谱抗菌活性使其具有重要的理论研究价值和开发成新型抗生素的潜力。自研究者从非洲爪蟾皮肤分泌物中发现第一个两栖动物皮肤抗菌肽开始，研究者已通过分离纯化和分子克隆手段从两栖动物皮肤分泌物中发现了上千种抗菌肽，这些多肽由10-50个氨基酸构成。目前研究者根据两栖动物抗菌肽的一级结构将其分成100多个不同的家族，这些不同家族的抗菌肽在分子量大小，电荷，疏水性，结构和功能上都不相同。通过这些抗菌肽的结构和功能的研究，不仅得到了许多高活性，具有广谱抗菌作用的多肽，而且利用抗菌肽结构与功能之间关系，研究者设计改进了许多天然抗菌肽。

不同来源的蛙皮肤抗菌肽在氨基酸组成和序列上存在显著差异，但是其二级结构却有很多相似性。研究者通过圆二色谱研究发现，许多抗菌肽，如来源于Xenopus laevis的23肽Magainin2，来源于Rana nigromaculata的抗菌肽temporin-1RNa、temporin-1RNb等在模拟细胞膜环境下会自发折叠成两亲的α-螺旋结构。这些抗菌肽通过作用于细菌细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。随着对抗菌肽结构与功能关系的深入研究，抗菌肽的医学价值越发明显，开发抗菌活性强，结构简单的抗菌肽已成为一个紧迫的任务。

沼水蛙（Hylarana guentheri）是中国南部地区常见两栖动物，其皮肤分泌物中含有多种抗菌肽。有研究表明，蛙科动物至少需要20-30种抗菌肽才能形成较好的抗菌屏障，而目前已报道的沼水蛙抗菌肽有9个，分别属于brevinin、temporin和guentherin家族，仍然有许多沼水蛙皮肤抗菌肽未被发现。沼水蛙皮肤抗菌肽的分离纯化和抗菌活性研究还需要进一步的加强，其二级结构及结构与功能关系研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供沼水蛙抗菌肽及其制备与应用，具体提供了一种制备简单，抑菌活性强的沼水蛙抗菌肽，并且可以将该抗菌肽应用于抗菌类药物的研制与开发。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种沼水蛙抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1 ：FLGALFKVASKLVPAAIRSISKK。

所述抗菌肽能够抑制常见细菌生长，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

所述抗菌肽在模拟细胞膜环境下会折叠成两亲性的α-螺旋结构。

抗菌肽衍生物为所述抗菌肽的一个或者几个氨基酸被取代，或者环化，或者L-型氨基酸变为D-型氨基酸，或者缺失，或者加入而得到同等功能的多肽。

一种与所述抗菌肽SEQ ID NO.1具有80%及以上同源性的多肽，该多肽功能与SEQ ID NO.1相同或相似；

一种抗菌肽序列的前端，中端或者末端包含权利要求1所述抗菌肽，该多肽与权利要求1所述抗菌肽功能相同或者相似；

所述抗菌肽可以从天然沼水蛙皮肤分泌物分离纯化或人工合成方法得到。

具体制备步骤为：

1）提取皮肤分泌物：捕捉福建地区野生沼水蛙，充分洗净，采用市售9V直流电池对沼水蛙耳后腺及背部腺体发达部分皮肤适度电刺激，待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，用体积比为0.05%三氟乙酸的去离子水冲洗分泌物，收集冲洗液冷冻干燥，即为沼水蛙皮肤分泌物粗提物；

2）分离纯化：取沼水蛙皮肤分泌物粗提物利用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值。收集具有最佳抗菌活性的峰，利用反相高效液相色谱进一步分离。反相高效液相色谱的洗脱梯度为0～5min，0～20%（v/v）乙腈；5～40min，20～70%（v/v）乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长214 nm，收集体积分数为50%乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗菌肽。

一种沼水蛙抗菌肽的应用于抗菌类药物的研制与开发。

本发明的优点在于：