[发明专利]含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化

权利要求书

1.一种含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化方法，其步骤为：酶解低分子量肝素利用凝胶色谱进行分离；分离后经除流动相、冷冻干燥后得到不同聚合度的肝素钠寡糖混合物；用SAX-HPLC分离收集得到高度硫酸化的肝素钠六糖；把收集到的肝素钠六糖经脱盐与冷冻干燥之后，通过阳离子交换，再用吡啶中和洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；将肝素吡啶六糖用DMSO：H₂O（v/v）=95：5溶剂溶解，选择性地脱除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖 ，经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖。

2.如权利要求1所述的制备以及纯化方法：其特征在于，具体步骤如下：

1)  肝素钠六糖的制备与提纯：酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.2M NH₄HCO₃为流动相,并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度；收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰, 经50-60℃水浴去除NH₄HCO₃，真空冷冻干燥后得到肝素钠六糖混合物；利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品;把收集到的肝素钠六糖粗品在超纯水中透析3天后，冷冻干燥;

2) 肝素吡啶六糖的制备：在4℃下，把步骤1）经过透析并冷冻干燥中获得的肝素钠六糖经过 H型阳离子交换树脂，去除糖链上的钠离子，所得的洗脱液在室温下用吡啶中和至pH为6-6.5；把中和后的洗脱液冷冻干燥，得到肝素吡啶六糖干品；

3)含GlcNH₃⁺肝素寡糖的制备和纯化：把步骤2）中获得的肝素吡啶六糖干品溶于DMSO：H₂O（v/v）=95：5溶剂中，经30-60℃水浴15-20min，选择性地脱除肝素链N位上的硫酸根；透析冷冻干燥后，用SAX-HPLC，在NaCl线性梯度洗脱下，分离收集含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖；把收集到的含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖，分别透析并冷冻干燥，得到纯化的含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖。

3.如权利要求2所述的制备以及纯化方法：其特征在于，步骤3）中水浴条件为30℃水浴20min反应条件下时，得到纯化的含一个、两个和三个GlcNH₃⁺的三种肝素六糖。

4.如权利要求2所述的制备以及纯化方法：其特征在于，步骤3）中水浴条件为60℃水浴20min反应条件下时，得到纯化的含三个GlcNH₃⁺的肝素六糖。