[发明专利]含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化

说明书

技术领域

本发明是关于制备含GlcNH₃⁺肝素寡糖的方法及其纯化，属于天然产物制备纯化领域。

背景技术

硫酸类肝素中存在12种具代表性的二糖，其中含GlcNAc、GlcNSO₃残基的二糖为主要存在形式，而带正电荷的GlcNH₃⁺残基的二糖含量微少，并且它的存在也因细胞与组织的来源不同而异。虽然含GlcNH₃⁺的硫酸类肝素含量微少，但它与病毒的侵入，炎症的发生，脑组织损伤等疾病都有着密切的关系，在生物体内扮演着重要的生物学与病理生理学角色。对含GlcNH₃⁺糖类化合物结构功能的研究，在疾病治疗及新糖类药物开发方面都有重要的意义。

随着研究的深入，对含不同结构肝素糖链样品的需求也大幅增加。据以往的文献报道，采用分离手段从生物材料中直接获取组分均一、结构明确的糖链非常困难。多采用化学修饰的方法，通过改变溶剂的极性，选择性地脱除肝素长链上不同位置上的硫酸基团，从而获得目标产物。Inoue Y等，使用5％水(或甲醇)/二甲亚砜溶液可选择性地脱除肝素吡啶盐中N位上的硫酸基团；Jaseja M等，通过pH=12.5-12.8的Na0H水溶液，α-L-艾杜糖醛酸片段上2S可以定量地脱除；Ayotte L等，使用9:1的Me₂SO-水，Hanno B 等使用N-甲基吡咯烷酮水溶液可选择性脱除6S；Dulce P G 等使用SO₃-Py、SO₃-DMF等硫酸化试剂可在糖链上的不同位置进行硫酸化反应，获得各种不同取代类型的多糖。

迄今为止，制备肝素寡糖的方法步骤繁多，价格昂贵。对硫酸类肝素酶解后得到的寡糖片段的骨架结构直接进行化学修饰的报道很少。批量获取含GlcNH₃⁺肝素寡糖的制备方法更是罕见。本发明用易获得的低分子量肝素为原料，简易的方法，制备出含不同GlcNH₃⁺数目和序列的系列肝素寡糖，为硫酸类肝素中GlcNH₃⁺残基的结构与功能及其与疾病关系的研究提供重要的糖库。

发明内容

本发明实验原材料为酶解的低分子量肝素。利用凝胶色谱分离不同聚合度的肝素钠六糖混合物，除掉流动相中的NH₄HCO₃后，用SAX-HPLC方法分离收集得到各种肝素钠六糖；脱盐与冷冻干燥之后，利用阳离子交换和吡啶中和法制备调节洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖；后用95%DMSO：5%H₂O溶剂，选择性地脱除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖。

本发明的具体技术方案为：

一种含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化方法，其步骤为：酶解低分子量肝素利用凝胶色谱进行分离；分离后经除流动相、冷冻干燥后得到不同聚合度的肝素钠寡糖混合物；用SAX-HPLC分离收集得到高度硫酸化的肝素钠六糖；把收集到的肝素钠六糖经脱盐与冷冻干燥之后，通过阳离子交换，再用吡啶中和洗脱液的pH至弱酸性，得到肝素吡啶六糖 ；将肝素吡啶六糖用DMSO：H₂O（v/v）=95：5溶剂溶解，选择性地脱除N位上的硫酸根，再用SAX-HPLC方法分离收集得到含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖 ，经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖。 

具体步骤如下：

1）肝素钠六糖的制备与提纯：酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.2M NH₄HCO₃为流动相,并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度；收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰, 经50-60℃水浴去除NH₄HCO₃，真空冷冻干燥后得到肝素钠六糖混合物；利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品;把收集到的肝素钠六糖粗品在超纯水中透析3天后，冷冻干燥;