[发明专利]一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ以及HCV反应液Ⅲ；

其中，HCV反应液Ⅰ用于检测HCV通用型和1b亚型，其包括以下引物序列和探针：

用于HCV通用型检测的引物序列是：

HCV-F：5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’；

HCV-R：5’-CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’；

对应的探针序列是：

HCV-P：5’-AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’；及

用于HCV1b亚型检测的引物序列是：

HCV1b-F：5’-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’；

HCV1b-R：5’-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’；

对应的探针序列是：

HCV1b-P：5’-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’；

其中，HCV反应液Ⅱ用于检测HCV2a和6a亚型，其包括以下引物序列和探针：

用于HCV2a亚型检测的引物序列是：

HCV2a-F：5’-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’；

HCV2a-R：5’-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3’；

对应的探针序列是：

HCV2a-P：5’-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3’；及

用于HCV6a亚型检测的引物序列是：

HCV6a-F：5’-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’；

HCV6a-R：5’-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’；

对应的探针序列是：

HCV6a-P：5’-TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’；

其中，HCV反应液Ⅲ用于检测HCV3a和3b亚型，其包括以下引物序列和探针：

用于HCV3a亚型检测的引物序列是：

HCV3a-F：5’-CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’；

HCV3a-R：5’-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’；

对应的探针序列是：

HCV3a-P：5’-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’；及

用于HCV3b亚型检测的引物序列是：

HCV3b-F：5’-GCACCAAAACCAAACTCACT-3’；

HCV3b-R：5’-GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3’；

对应的探针序列是：

HCV3b-P：5’-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括HCV分型阴性对照、HCV分型阳性对照及使用说明书，优选的，所述的HCV分型阴性对照为无HCV RNA的正常人血清样本；所述的HCV分型阳性对照为含有HCV1b亚型基因片段的非转染性体外转录RNA的人血清样本。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液中含有pH=8.0的Tris-HCl20mM、KCl100mM、dATP，dGTP，dCTP，dTTP各0.4mM、MgCl₂6mM。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液中含有200U/μL逆转录酶、40U/μL RNA酶抑制剂和2U/μL Taq酶。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ或HCV反应液Ⅲ中所含有的探针序列的5’端分别采用不同的荧光报告基团进行标记。