[发明专利]一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测试剂盒，尤其涉及一种采用多重荧光PCR检测方法，制备丙型肝炎病毒及其基因分型检测的试剂盒，用于快速准确检测临床血清或血浆样品中丙型肝炎病毒及国内主要流行亚型1b，2a，3a，3b，6a的感染。本发明属于生物技术领域。

背景技术

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原体，严重危害人类健康。它主要通过输血、静脉注射、母婴垂直等方式感染致病，可引起慢性肝炎，肝硬化，甚至肝癌。据世界卫生组织报道，目前全球约有2亿人感染HCV（至少包括130个国家），约占全球人口的3%，其中80%急性肝炎患者成为慢性肝炎，其中20%发展为肝硬化，1%-5%肝硬化患者可发展为肝癌。

HCV的基因组为单股正链RNA，长约9.6kb。根据其核苷酸序列的差异性，可将HCV分为6个主要的基因型，每个基因型又可分为多个亚型。HCV基因型的分布具有明显的地域差异，1-3型呈全球性流行，4-6型呈地方性流行。我国主要有1、2、3和6型4种HCV流行基因型，其中流行最广泛的亚型为1b和2a，其次为6a、3b和3a。HCV基因型与干扰素抗病毒治疗的应答密切相关，是决定丙型肝炎患者干扰素治疗效果的重要因素。不同基因型HCV感染者接受干扰素治疗后，持续病毒学应答（SVR）率有所不同,从而有助于预测治疗效果，为调整用药剂量及治疗时间，制定个体化抗病毒治疗方案提供指导。因此HCV基因型在临床上常作为药物疗效的预测指标。

HCV基因分型的方法主要有分子生物学和血清学两大类。在分子生物学分型法中，核苷酸测序法被认为是“金标准”，但由于测序设备的限制，广泛的临床应用存在一定困难。PCR-限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）法利用限制性内切酶可将6种基因型分开，但酶切位点易受到基因变异的影响。线性探针杂交（Line probe hybridization assay，LiPA）法操作较为繁琐，HCV RNA低载量患者的检测效果较差。实时荧光PCR法既可检测主要基因型，同时还能区分亚型。此外，还有型特异探针杂交、反向斑点杂交等分型方法。血清学基因分型主要是检测NS4区和核心区编码的抗原，常用的方法有重组免疫印迹试验（Recombinant Immunoblot Assay，RIBA）和酶免疫试验（Enzyme Immunoassay，EIA）。这两种方法对1、2、3基因型的辨别有96%的一致性，且操作简便。但用于检测HCV基因型特异性抗原的ELISA方法虽可以识别6种基因型，却不能识别亚型。而且一些研究表明，血清学分型可能在特异性和灵敏度方面有局限。近年国内外文献报道的HCV RNA基因分型的研究方法主要有HPLC酶切法、引物特异性电泳分型法、熔点曲线法、分管引物测序等方法，这几种方法均存在操作复杂、结果鉴定开放式或分管多步等缺陷，因此也没有成为临床常规开展的技术。本发明采用多重荧光PCR检测方法，可用于快速准确检测临床血清或血浆样品中丙型肝炎病毒及国内主要流行亚型1b，2a，3a，3b，6a的感染，具有操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病治疗等领域有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用多重荧光探针技术进行丙型肝炎病毒核酸及其基因型检测的试剂盒，通过该试剂盒的使用，能够快速、简便、敏感地检测HCVRNA及HCV基因型，从而为丙型肝炎的临床诊断和抗病毒治疗提供参考依据。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术手段为在HCV5’非编码区设计进行HCV通用型检测的引物和探针，同时分别针对HCV的各亚型（HCV1b、HCV2a，HCV6a、HCV3b和HCV3a）的NS5B基因区段设计用于HCV基因分型的引物和探针。在HCV核酸提取后，配制RT-PCR反应体系进行多重荧光PCR扩增，根据三个反应管的扩增结果判断HCV感染及其感染亚型。本发明扩增程序简单、操作简便、灵敏度高、特异性好、结果清晰，容易判断。

本发明是一种用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核酸检测和基因分型的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、酶混合液、HCV反应液Ⅰ、HCV反应液Ⅱ以及HCV反应液Ⅲ；

其中，HCV反应液Ⅰ用于检测HCV通用型和1b亚型，其包括以下引物序列和探针：

用于HCV通用型检测的引物序列是：