[发明专利]定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途

权利要求书

1.一种检测基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

(1)特异性扩增基因突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp；前引物与突变型基因位点及附近序列完全互补，长度为10-20bp；和

(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当EGFR基因突变为点突变时，所述的试剂盒中还包括：

(3)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补；较佳的，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，靶向基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸中，突变位点位于中间。

4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变，包括：

(a)组试剂：检测EGFR第21外显子的点突变：前引物SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，后引物SEQ ID NO:12，探针SEQ ID NO:13，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:15；

(b)组试剂：检测EGFR第20外显子790位的点突变：前引物SEQ ID NO:23，后引物SEQ ID NO:24，探针SEQ ID NO:25，Block寡聚核苷酸SEQ ID NO:27；

(c)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变：前引物SEQ ID NO:30，后引物SEQ ID NO:31，探针SEQ ID NO:32；

(d)组试剂：检测EGFR第19外显子缺失突变：前引物SEQ ID NO:33，后引物SEQ ID NO:34，探针SEQ ID NO:32；和

(e)组试剂：检测EGFR保守区域拷贝数：前引物SEQ ID NO:3，后引物SEQ ID NO:4，探针SEQ ID NO:5；

较佳地，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，(a)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM；

(b)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM，Block寡聚核苷酸浓度1500±600nM；

(c)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM；

(d)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM；或

(e)组试剂中，前引物浓度500±200nM，后引物浓度500±200nM，探针浓度100±40nM。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：TaqDNA聚合酶，镁离子，dNTP，扩增缓冲液，梯度校准品。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，每一组所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸分别与所述Taq DNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中；或

所述的梯度校准品与所述前引物、后引物、探针、Block寡聚核苷酸及TaqDNA聚合酶，镁离子，dNTP混合于一个体系中。

8.权利要求1-7任一所述的试剂盒的用途，用于检测基因突变。

9.一种检测基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：

(i)以待测基因为模板，以权利要求1-7任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；

(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的突变类型。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的试剂盒定量检测EGFR基因突变；并且，步骤(ii)包括：

(S1)利用(a)、(b)、(c)和(d)组试剂分别检测第21外显子的点突变拷贝数、第20外显子790位的点突变拷贝数、第19外显子缺失突变拷贝数；

(S2)利用(e)组试剂检测EGFR保守区域拷贝数：

(S3)将(S1)获得的各组突变拷贝数与(S2)中获得的保守区域拷贝数比较，获得EGFR基因各突变位点的突变比例。