[发明专利]定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高灵敏度定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途。

背景技术

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，因其五年的存活率只有15%。肺癌主要分两种类型：一类是非小细胞肺癌，另一类是小细胞肺癌。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的75-80%。大部分中晚期NSCLC患者，采用全身化学药物治疗。而一些早期NSCLC患者可以采用手术或者局部放化疗进行治疗。然而传统的化疗方案在中晚期NSCLC治疗中的疗效并不令人满意，且化疗的不良反应大，患者难以耐受。因此新的治疗方法急需开展。随着生物技术的发展，靶向抗肿瘤药物倍受关注。这些药物针对性强，能特异性地杀伤肿瘤细胞。其中，表皮生长因子受体(EGFR)是目前肿瘤靶向治疗，尤其是NSCLC治疗的重要靶点。

临床上通常采用小分子EGFR细胞内酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)来选择性抑制细胞内酪氨酸激酶的活化，中断其下游的信号转导，从而阻止肿瘤进展。EGFR-TKI靶向治疗药物代表有吉非替尼(Gefitinib，商品名为Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib，商品名为Tarceva)。然而，在Gefitinib和Erlotinib的临床试验和临床应用过程中，并不是所有的患者都受益，只有部分患者疗效显著。2004年，科学家发现了肺癌的EGFR基因突变，并且某些突变与Gefitinib和Erlotinib药物的疗效相关。香港中文大学的莫树锦领导的IPASS研究以及同济大学的周彩存教授牵头的OPTIMAL研究显示在EGFR敏感突变阳性的患者中，一线使用TKI药物比传统化疗的患者无进展生存期(Progression Free Survival，PFS)显著延长，表明在NSCLC患者的用药治疗选择上，EGFR基因是否发生突变是一个重要的预测因子。

EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，突变率最高的是19外显子的2种缺失突变(E746_A750del)和21外显子的点突变(L858R)，前期研究显示二者在所有EGFR基因突变中的比例占90%以上。这二者均属于敏感突变，意味着TKI药物的有效性。另外，临床上对于TKI药物有效的患者，在用药后期均会产生耐药性，研究显示，其中50%患者是在19外显子缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第20外显子790位密码子的突变(T790M)，因此在临床用药选择时，除敏感突变外，T790M耐药基因的检测也同样重要。

目前常用的EGFR基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法，这两种方法均为定性检测，存在一定的缺陷。测序法灵敏度较低约20%，且操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高。ARMS-PCR方法能够达到1%的灵敏度，对于肿瘤组织样本能够满足检测需求，但是对于取样方便的血液样本，如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量往往低于1%，ARMS-PCR方法不足以对血液进行检测。另外，最新研究表明，EGFR基因敏感突变的比例与靶向药物疗效关系密切，对于EGFR敏感突变比例较低的患者服用靶向药，药物的有效率会显著降低，与未发生突变的人群类似。测序法和ARMS-PCR方法均为定性检测，无法给出患者肿瘤组织中EGFR基因突变的比例，不足以判断突变弱阳性患者是否能受益于TKI治疗。

传统的定性检测仅能给出基因有无突变的信息，而无法判断肿瘤的敏感突变比例，并且无法对血液样本进行有效的检测，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。此外，在临床用药过程中产生的耐药性突变，以前的方法由于灵敏度不够也无法进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度定量检测EGFR基因突变的试剂盒及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种检测(较佳地为定量检测)基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)特异性扩增基因突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp(较佳地60-80bp)；前引物与突变型基因位点及附近序列完全互补，长度为10-20bp(较佳地12-18bp；更佳地12-16bp)；和

(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。