[发明专利]一种黑莓细胞悬浮培养液的制备方法

权利要求书

1.一种黑莓细胞悬浮培养液的制备方法，其特征在于：该制备方法通过农杆菌介导将γ-TMT基因表达载体转入黑莓外植体细胞中，经细胞悬浮培养后得到所述悬浮培养液；所述γ-TMT基因表达载体中包含编码γ-TMT的多核苷酸片段。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞悬浮培养采用MS培养液，pH 6.0-7.0，其中含蔗糖 25-30g/L、2,4-D 1.0-1.5mg/L、水解酪蛋白200-300mg/L；接种量为1-2g/50mL；暗培养15-25天。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述细胞悬浮培养采用MS培养基，pH 6.0，其中含蔗糖 30g/L、2,4-D 1.0mg/L、水解酪蛋白200mg/L；接种量为2g/50mL；培养温度为25±0.2℃；摇床转速为110r/min。

4.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表达载体采用植物表达载体。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表达载体采用PBI121载体。

6.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表达载体中包含的编码γ-TMT的多核苷酸片段通过以下方法制备：

（1）提取拟南芥总RNA；

（2）以拟南芥总RNA逆转录得到的cDNA，利用引物TMT-F：5’-CTTGGATCCATGAAAGCAACTCTAGCAGC-3’、TMT-R：5’-CGGGATCCGAGTGGCTTCTGGCAAGTGAT-3’进行PCR扩增，即得所述编码γ-TMT的多核苷酸片段。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述γ-TMT基因表达载体通过以下步骤制备：

（1）利用pMD19-T载体连接所述编码γ-TMT的多核苷酸片段后，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选出转化子，进行PCR扩增，提取得到含有编码γ-TMT的基因的克隆载体pMD-TMT；

（2）取步骤（1）得到的克隆载体pMD-TMT及pBI121载体采用BamH I酶切后，经T4连接酶连接后转化大肠杆菌感受态细胞，提取得到重组质粒pBI121-TMT；所述重组质粒pBI121-TMT即为所述γ-TMT基因表达载体。

8.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于：所述农杆菌介导采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105。

9.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于：所述黑莓外植体细胞采用黑莓种子产生的胚性愈伤组织。