[发明专利]一种黑莓细胞悬浮培养液的制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种黑莓细胞悬浮培养液的制备方法，具体涉及一种富含α-生育酚的悬浮培养液的制备方法。

背景技术

维生素E是一种脂溶性的强抗氧化剂，自然界中只在植物和其他光合生物中合成，是人体和动物必须从食物中摄取的微量营养素之一，缺乏时很容易出现生殖系统的萎缩和损害，故又称之为“生育酚”（tocopherol）。维生素E具有多种生理功能，历来倍受重视，被广泛地应用于食品、化妆品、医药和动物饲料制品中。

维生素E由四种生育酚（α-，β-，γ-，δ-生育酚）和四种生育三烯酚（α-，β-，γ-，δ-生育三烯酚）组成，其中α-生育酚活性最高，因为人及动物组织中的α-生育酚结合蛋白（α-TTP）可优先结合α-生育酚。然而，大多数作为天然维生素E来源的油料作物如油菜、花生、大豆的种子中，V_E的主要成分是γ-生育酚和δ-生育酚，而活性较高的α-生育酚含量较低，即便是合成维生素E中α-生育酚所占的比例也不大。

黑莓是一种小桨果类果树，其果实中富含亚油酸、花青素、维生素E、γ-氨基丁酸、超氧化物歧化酶（SOD）等营养保健成分，其种子中维生素E的含量（198.0 mg/100 g）远高于葵花籽（59.0 mg/100 g）和葡萄籽（55.4 g/100 g），而且其维生素E中γ-生育酚含量为41-109 mg/100g，α-生育酚含量为9.7-37.8mg/100g，δ-生育酚较少。

通过植物特定组织的培养来获取具有目标活性的天然产物，已经被证明是一种行之有效的获取天然活性物质的途径。细胞悬浮培养是这一方法的核心技术，它具有代谢产物的生产条件可控、可以通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物产量的代谢产物等优点。通过富含维生素E的红花、小麦胚芽、向日葵细胞培养生产高活性的生育酚已有报道。γ-TMT基因主要是调控γ-生育酚转化为α-生育酚，已有研究报道γ-TMT基因在拟南芥种子和大豆种子中的超量表达，使种子中维生素E的含量及其中α-生育酚的比例大幅度提高。

利用黑莓种子中维生素E（尤其是α-生育酚）含量丰富的特点，外加转γ-TMT基因调控，通过细胞悬浮培养制备维生素E，可以为工厂化生产高活性天然维生素E开辟一条新途径。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种富含α-生育酚的悬浮培养液的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种转基因黑莓体细胞悬浮培养液的制备方法，该方法通过农杆菌介导将γ-TMT（γ-tocopherol methyl- transferase，γ-生育酚甲基转移酶）基因表达载体转入黑莓外植体细胞中，经细胞悬浮培养后提取得到悬浮培养液；其中γ-TMT基因表达载体中包含编码γ-TMT的多核苷酸片段。

上述细胞悬浮培养采用MS培养基，pH 6.0-7.0（优选6.0），其中含蔗糖 25-30g/L（优选30g/L）、2,4-D 1.0-1.5mg/L（优选1.0 mg/L）、水解酪蛋白200-300mg/L（优选200 mg/L）；接种量为1-2g/50mL（优选2g/50mL）；暗培养15-25天；培养温度及摇床转速采取细胞悬浮培养常用条件，优选培养温度为25±0.2℃，优选摇床转速为110r/min。

本发明中用于细胞悬浮培养的黑莓体细胞中导入了γ-TMT基因，该基因的克隆、载体构建和导入方法如下：

（1）拟南芥总RNA的提取。

（2）γ-TMT基因克隆：以拟南芥总RNA反转录所得到的第一条cDNA链为模板，利用引物（TMT-F：5’-CTTGGATCCATGAAAGCAACTCTAGCAGC-3’和TMT-R：5’-CGGGATCC GAGTGGCTTCTGGCAAGTGAT-3’）进行PCR扩增，扩增产物凝胶电泳，经与Marker比对和测序确认，得到γ-TMT基因全长片段。

（3）基因表达载体构建：利用pMD19-T载体连接所述编码γ-TMT的多核苷酸片段后，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选出转化子，进行PCR扩增，提取得到含有编码γ-TMT的基因的克隆载体pMD-TMT；pMD-TMT载体及pBI121载体经BamH I酶切后，以T4连接酶连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取得到重组质粒pBI121-TMT，即为γ-TMT基因表达载体。