[发明专利]甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；

所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'和Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH₂O补充体积至20μL。

2.如权利要求1所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：

（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；

（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和Leptin*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；

（3）步骤（2）中检测到的带型与Leptin*C标准样带型一致的样品为携带影响甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。

3.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：

（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存；

（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；

（3）聚合酶链式反应：

PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F和Leptin-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；

引用引物序列为：

Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'

Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'

（4）PCR产物的SSCP检测：

取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，10℃电泳16h，银染法显色后拍照；

（5）结果判断：

对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子的PCR-SSCP检测，有4个等位基因，影响甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为Leptin*C的核苷酸序列为：

对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的Leptin*A核苷酸序列或Leptin*B核苷酸序列或Leptin*D核苷酸序列。