[发明专利]甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到绵羊生长速度的相关基因检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

瘦素（Leptin）是由肥胖基因（obese gene）编码，由脂肪细胞分泌的一种多肽激素（Trayhurn et al.,1996）。它可以通过增加能量的释放、基础代谢率和非颤抖性产热来增强动物适应寒冷环境的耐受能力（Peino et al.,2000；Grosfeld et al.，2002；Li et al.，2005），在适应高海拔低温缺氧环境中的能量平衡方面起重要作用。作为研究牛、羊生长发育、肉质等性状的重要候选基因，Leptin对家畜的青春期发育（Chen et al.，2000）、生殖器官发育（Ducy et al.，2000）、繁殖性能（Korner et al.，1999）、妊娠（Mercer et al.，2000）、胚胎发育（Chagnon et al.，2000）以及造血系统（Jin et al.，2000）都有调节功能。是研究家畜生产性能等经济性状的最佳标记基因之一。 

绵羊Leptin基因定位在4q32上，由3个外显子和2个内含子组成，编码序列主要在第2和第3外显子上。截止目前，在绵羊Leptin基因第3外显子上发现了5个等位基因（Zhou et al.，2009），在第2外显子上没有发现多态性（黄丹丽等，2008）。绵羊Leptin基因多态性与其摄食水平（Marie et al.2001）、饮食营养价值（Blache et al.2000）、体脂肪量（Delavaud et al.2000）、肌肉生长及肉质性状（Boucher et al.2005）具有相关性。 

目前Leptin基因已成为绵羊生长性状的候选基因而被国内外广泛研究，并在分子遗传育种标记方面加以应用。绵羊生长速度相关基因分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测绵羊的Leptin基因第3外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的绵羊生长速度的强弱，从而判断是否可以留作种用。 

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低，用于甘肃高山细毛羊生长速度相关基因分子选种技术。 

通过PCR-SSCP对甘肃高山细毛羊Leptin基因第3外显子进行遗传多态性分析，并测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合生产性能相关的生产数据，确定控制生长速度的等位基因，为改善甘肃高山细毛羊生产性能提供指导。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： 

一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点在于包括有PCR反应液，Leptin*C的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1； 

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0； 

所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg²⁺浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物Leptin-F:5’TACCAACAGATCCTCGCCAGTC3'和Leptin-R:5’CTTCAAGGCTTCAGCACCCA3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。 

所述的Leptin*C的DNA标准样的核苷酸序列为： 

所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因Leptin的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为： 

（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min； 

（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和Leptin*C的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测； 

（3）步骤（2）中检测到的带型与Leptin*C标准样带型一致的样品为携带影响甘肃 高山细毛羊生长速度等位基因的个体。