[发明专利]一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，含有如下物质：

（1）结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库；

所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽中的全部或部分组成；

（2）经荧光染料A标记的抗CD3的抗体；

（3）经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体；

（4）高尔基体阻断剂；

所述荧光染料A和所述荧光染料B所发荧光颜色不同。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有说明书；

所述说明书中记载：按照包括如下步骤的方法检测待测个体是否被结核分枝杆菌感染：

（a）向离体的待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h；

（b）向步骤（a）的体系中加入所述高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h；

（c）将步骤（b）的体系离心后，向沉淀中加入细胞固定液，避光反应15-25min，再加入通透缓冲液；

（d）向步骤（c）的体系中加入所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min；

（e）将步骤（d）的体系离心，取细胞沉淀，加入染色缓冲液，进行流式细胞检测；

（f）结果判断：若经所述流式细胞仪检测，双阳性细胞的比例大于0.2%，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上，则所述待测个体被结核分枝杆菌感染或候选被结核分枝杆菌感染；反之，则所述待测个体未被结核分枝杆菌感染或候选未被结核分枝杆菌感染；

所述对空对照组为：与如上步骤（a）-（f）相比，仅缺少步骤（a）中所述“向待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”的步骤；

所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述抗CD3的抗体为抗CD3的单克隆抗体；和/或

所述抗γ-干扰素的抗体为抗γ-干扰素的单克隆抗体。

4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述经荧光染料A标记的抗CD3的抗体为经异硫氰酸荧光素标记的抗CD3的单克隆抗体；和/或

所述经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体为经R-藻红蛋白标记的抗γ-干扰素的单克隆抗体。

5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有T细胞非特异性刺激物；

所述T细胞非特异性刺激物具体为植物凝集素或刀豆蛋白A。

6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有细胞固定液和/或通透缓冲液。

7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有染色缓冲液。

8.权利要求1-7中任一所述的试剂盒的制备方法，包括将所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库、所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体、所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体和所述高尔基体阻断剂分别单独包装的步骤。

9.权利要求1-7中任一所述的试剂盒在利用外周血体外检测结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞免疫反应中的应用。

10.一种检测外周血中是否含有结核分枝杆菌特异性T细胞的方法，包括如下步骤：

（a）向离体的待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h；

（b）向步骤（a）的体系中加入所述高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h；

（c）将步骤（b）的体系离心后，向沉淀中加入所述细胞固定液，避光反应15-25min，再加入所述通透缓冲液；

（d）向步骤（c）的体系中加入所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min；

（e）将步骤（d）的体系离心，取细胞沉淀，加入所述染色缓冲液，进行流式细胞检测；

（f）结果判断：若经所述流式细胞仪检测，双阳性细胞的比例大于0.2%，且为空白对照组中双阳性细胞比例的两倍以上，则所述待测外周血中含有或候选含有结核分枝杆菌特异性T细胞；反之，则所述待测外周血中不含有或候选不含有结核分枝杆菌特异性T细胞；

所述对空对照组为：与如上步骤（a）-（f）相比，仅缺少步骤（a）中所述“向待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库”的步骤；

所述双阳性细胞为被如下两种抗体同时标记的细胞：所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体。