[发明专利]一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用，特别涉及一种基于流式细胞术利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，据WHO资料估计，全球约三分之一的人口受结核分枝杆菌隐性感染，每年新发活动性感染病例九百多万，死亡一百万例以上。近年来，我国结核病发病率居高不下，每年新发病例超过一百万，死亡近二十万例，对我国公民的健康、社会的安定和经济的发展带来严重的危害。

结核病的早期诊断对于控制患者疾病进展和感染的蔓延具有重要意义。目前，结核病临床诊断仍然缺乏高灵敏度和高特异性的手段。传统的结核菌素皮下试验所用的抗原（PPD）因为能够跟卡介苗（BCG）的接种产生交叉反应使得其产生较高比例的假阳性，而临床诊断的“金标准”结核菌培养则有时间长，阳性率低等缺陷。另外，基于X射线透射和临床表现的诊断则特异性较低，容易与其他肺部感染或疾病相混淆。

免疫学研究表明，结核分枝杆菌作为一种胞内寄生菌，其分泌的一些蛋白能够激发高水平的T细胞免疫反应，而针对这些蛋白中包含的T细胞表位特异性T细胞检测给TB的诊断带来了新的机遇。通过结核杆菌与BCG菌株基因组的研究比较发现了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段RD1，针对RD1区编码的蛋白ESAT-6和CFP-10特异性T细胞分泌产生的IFN-γ的检测（IGRAs），催生了两种商品化结核诊断试剂盒，即基于酶联免疫斑点技术（ELISPOT）的T-SPOT.TB和基于酶联免疫吸附技术（ELISA）的QuantiFERON-TB Gold。目前，这两种诊断试剂盒已经分别于2007年和2008年在美国得到FDA批准上市，作为结核病临床诊断的辅助手段。ELISPOT方法需要对外周血样本进行分离，得到外周血单个核细胞并对细胞进行计数后方可进行后续的抗原刺激等试验，同时对相关实验与检测仪器的要求较高，在临床单位的普及率不高。

然而，中国特殊的结核病流行病学及生态环境、由于专利保护产生的高成本，使得这些诊断产品并不适用于中国广泛的临床诊断应用，因此亟需开发具有自主知识产权的结核病快速诊断试剂。此外绝大多数免疫检测方法如ELISPOT方法均需要首先从全血中分离外周血单个核细胞并对细胞进行计数后方可进行检测，因此开发一种利用全血直接进行相关检测实验的方法可大大提高相关试剂在临床的适用性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒。

本发明所提供的利用外周血检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，具体可含有如下物质：

（1）结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库；

所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽中的全部或部分组成；

（2）经荧光染料A标记的抗CD3的抗体；

（3）经荧光染料B标记的抗γ-干扰素的抗体；

（4）高尔基体阻断剂；

所述荧光染料A和所述荧光染料B所发荧光颜色不同。

在所述试剂盒中，所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库中的多肽既可为每条独立包装，也可按照等质量混合以后一起包装。

在本发明中，所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库由序列表中序列1-19所示氨基酸序列组成的19条多肽组成。

在所述试剂盒中，还含有说明书；

所述说明书中记载：按照包括如下步骤的方法检测待测个体是否被结核分枝杆菌感染：

（a）向离体的待测外周血中加入所述结核分枝杆菌Rv3615c混合多肽肽库，37℃孵育14-18h（如18h）；

（b）向步骤（a）的体系中加入所述高尔基体阻断剂，37℃孵育4-6h（如6h）；

（c）将步骤（b）的体系离心后，向沉淀中加入细胞固定液，避光反应15-25min（如20min），再加入通透缓冲液；

（d）向步骤（c）的体系中加入所述经荧光染料标记的抗CD3的抗体和所述经荧光染料标记的抗γ-干扰素的抗体，避光反应20-30min（如30min）；

（e）将步骤（d）的体系离心，取细胞沉淀，加入染色缓冲液，进行流式细胞检测；